Inmunogenicidad de una vacuna de Plasmodium vivax basada en la proteína de unión duffy formulada con adyuvantes compatibles para su uso en humanos

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13904 (2023) Citar este artículo

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La invasión de los reticulocitos por los merozoitos de Plasmodium vivax depende de la interacción de la proteína de unión a Duffy de Plasmodium vivax (PvDBP) con el receptor del antígeno Duffy para quimiocinas (DARC). La región II N-terminal rica en cisteína de PvDBP (PvDBPII), que se une a DARC, es una de las principales vacunas candidatas contra la malaria contra P. vivax. Aquí, hemos evaluado la inmunogenicidad de PvDBPII recombinante formulado con los adyuvantes Matrix-M y GLA-SE en ratones. El análisis de las respuestas de los anticuerpos reveló títulos de reconocimiento ELISA comparables, así como un reconocimiento similar de PvDBP nativo en esquizontes de P. vivax mediante ensayo de inmunofluorescencia. Además, los anticuerpos provocados por las dos formulaciones de adyuvante tenían propiedades funcionales similares, como avidez, perfil de isotipo e inhibición de la unión de PvDBPII-DARC. Además, los anticuerpos anti-PvDBPII pudieron bloquear la interacción de DARC con el alelo homólogo PvDBPII SalI, así como con el alelo heterólogo PvDBPII PvW1 de un aislado clínico tailandés que se utiliza para infecciones controladas de malaria humana (CHMI). La reactividad cruzada de estos anticuerpos con PvW1 sugiere que la inmunización con la cepa PvDBPII SalI debería neutralizar la invasión de reticulocitos por la cepa de desafío P. vivax PvW1.

De las cinco especies de Plasmodium que infectan a los humanos, P. falciparum y P. vivax son las más predominantes. Si bien P. falciparum es el más virulento, P. vivax tiene la distribución geográfica más amplia en todo el mundo1. Las medidas de prevención y control han dado como resultado una disminución sustancial de los casos de malaria y de la mortalidad relacionada con la malaria en las últimas dos décadas2. Sin embargo, se descubrió que las medidas de control eran más efectivas para P. falciparum que para P. vivax, debido a la biología única de P. vivax3. La aparición temprana de gametocitos de P. vivax conduce a una rápida transmisión incluso antes de que aparezcan los primeros síntomas clínicos y el paciente busque tratamiento. Además, la etapa latente de hipnozoíto en el hígado, que es indetectable, puede causar una infección en etapa sanguínea semanas, meses o años después de la infección inicial. Se necesitan nuevas herramientas si queremos lograr la eliminación de P. vivax. Una vacuna eficaz puede desempeñar un papel importante para lograr este objetivo.

Los síntomas clínicos de la malaria se atribuyen enteramente a la etapa sanguínea del ciclo de vida de P. vivax, que implica la infección de los reticulocitos, la replicación intracelular y la salida de merozoitos de próxima generación que luego invaden los reticulocitos frescos. A medida que avanza el ciclo de invasión y replicación, la parasitemia aumenta y provoca síntomas clínicos cuando se cruza el umbral de la fiebre. La invasión de reticulocitos por P. vivax es un proceso complejo que implica múltiples interacciones receptor-ligando. Una interacción clave que parece ser esencial para la invasión está mediada por la interacción de la proteína de unión a Duffy (PvDBP) de P. vivax con el receptor del antígeno Duffy para quimiocinas (DARC) en los reticulocitos4,5. El dominio de unión de PvDBP se mapeó en una región rica en cisteína conservada de 39 kDa, denominada región II (PvDBPII)6. Tras la exposición natural, se ha demostrado que las respuestas de anticuerpos inhibidores de unión provocadas contra PvDBPII se correlacionan con la protección contra la infección por P. vivax7,8. Además, se descubrió que estos anticuerpos inhibidores de la unión anti-PvDBPII de alto título pueden bloquear la unión a DARC mediante diversas variantes de PvDBPII.

PvDBPII basado en la secuencia de referencia Salvador I (SalI) se ha expresado como un antígeno de vacuna recombinante en E. coli y se ha purificado hasta homogeneidad en su conformación nativa9,10,11,12. El PvDBPII recombinante formulado con diversos adyuvantes fue probado en modelos animales10,12,13. En estos estudios, se descubrió que PvDBPII formulado con una emulsión estable de adyuvante lipídico de glucosilpiranosilo (GLA-SE) provocaba anticuerpos inhibidores de la unión anti-PvDBPII de alto título que trascendían la cepa y bloqueaban la unión al receptor mediante diversos dominios polimórficos de PvDBPII. Estas observaciones de estudios preclínicos y de campo proporcionan la justificación para el desarrollo de una vacuna basada en PvDBPII que podría proteger contra diversas cepas de P. vivax. Posteriormente, PvDBPII/GLA-SE se probó en un ensayo clínico de Fase I de aumento de dosis, que demostró que era seguro e inmunogénico y provocaba anticuerpos inhibidores de unión de títulos altos contra PvDBPII14.

En este momento, otros adyuvantes como el adyuvante Matrix-M basado en saponina extraído de Quillaja saponaria (QS)15 están disponibles y se estaban utilizando para la formulación de vacunas experimentales basadas en proteínas recombinantes, incluida la vacuna R21 contra P. falciparum basada en el proteína circumsporozoito (PfCSP)16. R21 formulado con Matrix-M demostró excelentes perfiles de seguridad e inmunogenicidad17. Además, una vacuna basada en PvCSP, Rv21, adyuvada con Matrix-M mostró protección en ratones en estudios preclínicos18. Dado el potencial de combinar PvDBPII con una vacuna basada en PvCSP como Rv21, se decidió evaluar la inmunogenicidad de PvDBPII formulada con Matrix-M. Aquí, probamos la inmunogenicidad de PvDBPII formulado con Matrix-M y GLA-SE en ratones. PvDBPII formulado con Matrix-M o GLA-SE provoca niveles similares de anticuerpos específicos de PvDBPII de alto título que bloquean la unión del receptor a la variante homóloga SalI de PvDBPII. También se analizaron los anticuerpos provocados por PvDBPII SalI para determinar la inhibición de la unión al receptor por PvDBPII derivado del aislado clínico tailandés de P. vivax PvW119, que se ha desarrollado como una cepa de desafío en etapa sanguínea para evaluar la eficacia de las vacunas en infecciones controladas de malaria humana (CHMI). ). Los anticuerpos provocados por PvDBPII SalI recombinante formulado con Matrix-M y GLA-SE inhibieron la unión del receptor por PvDBPII PvW1 con una eficacia similar. Estas observaciones demostraron la capacidad de PvDBPII recombinante formulado con Matrix-M y GLA-SE para provocar potentes anticuerpos de reacción cruzada que podrían proteger potencialmente contra la infección por la cepa de desafío heteróloga P. vivax PvW1.

Las variantes recombinantes de PvDBPII SalI y PvW1 se produjeron como se describió anteriormente9,10,11,12. Brevemente, el gen con codones optimizados PvDBPII se clonó en el vector pET28a (+) (que incluye una etiqueta C-terminal 6xHis) y el plásmido resultante se usó para transformar la cepa BLR(DE3) de E. coli. PvDBPII se expresó mediante un proceso de fermentación por lotes alimentados, las células se lisaron y PvDBPII se solubilizó y purificó mediante cromatografía de afinidad con ácido nitrilotriacético cargado de níquel (Ni-NTA). PvDBPII se replegó mediante el método de dilución rápida, se dializó y finalmente se purificó mediante cromatografía de intercambio catiónico (columna SP Sepharose) y filtración en gel (columna Superdex 200). La pureza de la proteína se evaluó mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE), acrilamida al 12% y se tiñó con solución de tinción de proteínas PageBlue (Thermo Fisher). El PvDBPII recombinante marcado con His se detectó mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-His de ratón primario (dilución 1:500, Sigma) y un anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante secundario (HRP) (dilución 1:2500, Sigma). El plegamiento correcto de la proteína PvDBPII recombinante se confirmó en ensayos de unión funcional a eritrocitos y de unión a DARC como se describe a continuación. El PvDBPII monomérico final se almacenó a -80 °C.

Dos plásmidos que codifican la secuencia DARC N-terminal (nDARC) (primeros 60 codones de DARC humano (FyB) con la tirosina (Y) o fenilalanina (F) en la posición 41) fusionados a la región Fc de la IgG1 humana en el vector de expresión de mamíferos pCDM8 se utilizaron para la expresión en células HEK293T de mamíferos20. El plásmido que contiene la tirosilproteína sulfotransferasa-2 humana (TPST-2) se cotransfectó con los plásmidos DARC para asegurar la sulfatación del DARC recombinante. El nDARC(Y)-Fc o nDARC(F)-Fc recombinante se purificó a partir de sobrenadantes de cultivo mediante cromatografía de afinidad con proteína G y se almacenó a -80 °C.

Se inmunizaron dos grupos de cinco ratones BALB/c cada uno con 15 μg de PvDBPII variante SalI formulada con 5 μg de Matrix-M o 1 μg de GLA-SE con una dosis inicial el día 0 y dos refuerzos los días 28 y 56. Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio del Instituto Pasteur y las directrices ARRIVE. Se recogieron muestras de suero los días 1, 27, 55 y 70. El protocolo ELISA que se describe a continuación se realizó en muestras de los días 0, 27, 55 y 70. El ensayo de inhibición de unión, avidez, isotipado y ensayo de inmunofluorescencia (IFA) se realizaron solo de muestras de suero del día 70.

Los glóbulos rojos humanos (RBC) se obtuvieron de donantes duffy positivos (Fy+) y duffy negativos (Fy-). Se obtuvo un consentimiento informado por escrito de los pacientes antes de la inscripción. Todos los procedimientos se llevaron a cabo en estricta conformidad con las directrices y regulaciones pertinentes. Para el fenotipado duffy, se analizaron 2 ml de sangre completa mediante hemaglutinación inmunológica. Los sujetos se consideraron duffy negativos cuando sus glóbulos rojos no albergaban antígenos FyA o FyB, mientras que los sujetos se consideraron duffy positivos cuando sus glóbulos rojos albergaban antígenos FyA o FyB o ambos. Los glóbulos rojos (1 x 108) se incubaron con 1 μg de PvDBPII SalI o PvW1 en 100 μl de medio 1640 de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Life Technologies) con 10% de suero bovino fetal (FBS, Sigma) durante 45 minutos a temperatura ambiente. temperatura con rotación. Después de la incubación, la mezcla se colocó sobre aceite de cojín, compuesto por 85% de silicona (SERVA) y 15% de nujol (Thermo Fisher), y se centrifugó para recolectar los glóbulos rojos. Las proteínas unidas a los glóbulos rojos se eluyeron con cloruro de sodio (NaCl) 300 mM, se separaron mediante SDS-PAGE y se detectaron mediante transferencia Western.

Los ensayos de unión y de inhibición de la unión a DARC se realizaron como se describe en otro lugar20. Se recubrieron placas ELISA Nunc MaxiSorp (Thermo Fisher) con proteínas recombinantes nDARC(Y)-Fc o nDARC(F)-Fc (1 μg/ml) durante la noche a 4 °C en tampón carbonato-bicarbonato (cápsulas, Sigma). Al día siguiente, la placa se lavó 3 veces con PBS 0,05% Tween (PBS/T) y se bloqueó durante 2 h a 37 °C utilizando 200 µl de PBS/T de leche desnatada al 2%. Se agregaron PvDBPII SalI o PvW1 recombinantes (0,8–25 ng/ml) por duplicado a placas recubiertas con DARC. El PvDBPII unido a DARC se sondeó con sueros policlonales de conejo anti-PvDBPII (dilución 1:10 000) a 37 °C durante 1 h y se detectó con anticuerpo secundario IgG anti-conejo conjugado con peroxidasa (dilución 1:10 000, Sigma) a 37 °C durante 1 h. El ensayo se desarrolló a temperatura ambiente utilizando 100 µl del sustrato cromogénico de dos componentes para la detección de peroxidasa, TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbencidina, Life Sciences), durante 5 minutos. La reacción se detuvo con 100 µl de ácido fosfórico 1 M (H3PO4). La densidad óptica se midió inmediatamente a una longitud de onda de 450 nm (OD450).

Para el ensayo de inhibición de la unión, se agregaron PvDBPII SalI o PvW1 (0,8–25 ng/ml) en placas recubiertas con nDARC(Y)-Fc prebloqueadas y se usaron para generar una curva estándar de PvDBPII. Las muestras de suero se analizaron en diluciones de 1:100 a 1:24.300. Cada dilución de suero se incubó con 25 ng/ml de PvDBPII SalI o PvW1 a 37 °C durante 30 min. La mezcla de reacción se añadió a placas recubiertas con DARC por duplicado y se incubó a 37 °C durante 1 h. PvDBPII unido a DARC se detectó como se describe anteriormente. La cantidad de PvDBPII unido se estimó convirtiendo los valores de DO450 en concentraciones de proteína utilizando un modelo logístico de cuatro parámetros que se ajusta a la curva estándar de PvDPBII. Los valores de concentración de proteína interpolados se usaron para calcular el porcentaje (%) de unión para cada dilución de muestra de suero. Luego, el % de inhibición de la unión para cada dilución de suero se calculó de la siguiente manera: % de inhibición de la unión = 100 − % de unión. Se utilizó la gráfica del % de inhibición de unión versus dilución de suero para encontrar la dilución de suero en la que se logra el 50% de inhibición de unión (CI50) para cada muestra de suero.

La unión de PvDBPII con DARC se analizó mediante la técnica de interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED 384 (Fortebio). Todas las mediciones se realizaron a 25 °C en placas de microtitulación de 96 pocillos Greiner negras estándar en un volumen de 120 µl/pocillo con agitación a 1000 rondas por minuto (rpm). Se usó un tampón que consistía en PBS con 1 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) como control, para las etapas de referencia/disociación y para diluir proteínas recombinantes. PvDBPII SalI y PvW1 se diluyeron a concentraciones que oscilaban entre 1 y 120 nM. Los biosensores de captura de Fc de IgG antihumano (AHC) (Sartorius) se hidrataron durante 10 minutos en PBS y se regeneraron (3 ciclos, 30 s cada uno) con glicina 10 mM, pH 1,5. La proteína nDARC(Y)-Fc recombinante se inmovilizó mediante su Fc a 20 μg/ml durante 600 s. Los biosensores de referencia se prepararon cargando proteína Fc IgG1 humana (Thermo Fisher) a 5 μg/ml durante 600 s en biosensores AHC. Se analizó la unión de los biosensores cargados a PvDBPII SalI o PvW1 con la siguiente secuencia de pasos: línea de base (60 s en tampón), asociación (con diluciones de PvDBPII recombinante durante 3600 s) y disociación (600 s en tampón). Los pocillos que contenían únicamente tampón se asignaron como pocillos de muestra de referencia. Se restaron las señales de los biosensores de referencia y los pocillos de muestra de referencia para determinar las señales de unión específicas de PvDBPII-DARC. Las constantes de afinidad (KD) se determinaron ajustando los perfiles de asociación/disociación utilizando un modelo de unión 1:2 y realizando un análisis de estado estacionario utilizando el software Octet Data Analysis HT versión 11 (Fortebio). Se realizaron y promediaron dos experimentos independientes para informar la KD de cada proteína PvDBPII con desviaciones estándar (SD).

Las placas Nunc MaxiSorp ELISA se recubrieron con 100 µl de proteínas PvDBPII SalI o PvW1 recombinantes a 1 µg/ml en tampón carbonato-bicarbonato durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, las placas se lavaron tres veces con PBS/T y se bloquearon con PBS/T de leche desnatada al 5% durante 1 h a 37 °C. Los sueros de ratón se diluyeron en PBS/T de leche desnatada al 2,5% (dilución inicial 1:2000) y se añadieron 100 µl por pocillo por duplicado y se incubaron durante 1 h a 37 °C. Después de lavar con PBS/T, los anticuerpos unidos se detectaron añadiendo 100 µl de anticuerpo IgG anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (dilución 1:3000, Promega) e incubando durante 1 h a 37 °C. El ensayo se desarrolló como se describe anteriormente en el protocolo del ensayo de unión a DARC. Se utilizaron valores de DO450 y diluciones de suero para ajustar un modelo logístico de cuatro parámetros. Se informa la concentración sérica efectiva a la que se observó una unión del 50% (CE50).

PvDBPII SalI y PvW1 se recubrieron sobre placas ELISA como se describe anteriormente en el protocolo ELISA. Se incubaron pocillos recubiertos con PvDBPII con muestras de suero diluidas para dar una DO450 de ~2,0 por duplicado. Después de la incubación de la muestra, se agregaron concentraciones descendentes del agente caotrópico tiocianato de sodio (NaSCN, Sigma) (7 M a 0 M en PBS) (100 μl) y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS/T y la reacción se desarrolló según el protocolo de ensayo de unión a DARC descrito anteriormente. Los valores de DO450 se representaron frente a la concentración de NaSCN y se ajustaron en un modelo logístico de cuatro parámetros. La concentración de NaSCN que resultó en una reducción del 50 % de la DO450 se utilizó como medida de avidez (IC50).

El ensayo se realizó como se describe para el protocolo ELISA anterior, excepto que los isotipos y subclases de ratón se detectaron utilizando los reactivos de isotipado de anticuerpo monoclonal de ratón ISO2-1KT (Sigma). Brevemente, se incubaron placas de ELISA recubiertas previamente con PvDBPII SalI con muestras de suero diluidas a 1:400, 1:4000 y 1:40.000 por duplicado. Después de lavar los pocillos con PBS/T, los anticuerpos de cabra contra IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA e IgM de ratón se diluyeron a 1:1000 y 100 µl y se añadieron a los pocillos de ELISA. Después de 1 h de incubación a 37 °C, las placas se lavaron y se añadió anticuerpo anti-cabra conjugado con HRP (Promega) (100 µl a dilución 1:5000). Después de una incubación de 1 h a 37 °C, la reacción se desarrolló como se describe anteriormente en el protocolo del ensayo de unión a DARC. Se utilizó la DO450 de cada muestra para evaluar la subclase de IgG, el isotipo IgA o IgM.

Para IFA se utilizó un aislado clínico recolectado de un paciente con malaria por P. vivax en Camboya durante estudios de campo realizados por el Institut Pasteur du Cambodge y la secuencia de PvDBPII se determinó mediante secuenciación de Sanger como se describió anteriormente21. Se obtuvo un consentimiento informado por escrito del paciente antes de la inscripción. Todos los procedimientos se llevaron a cabo en estricta conformidad con las directrices y regulaciones pertinentes. El aislado clínico de P. vivax maduró hasta el estadio de esquizonte en cultivo. Los esquizontes se purificaron en Percoll y se utilizaron para preparar portaobjetos para su uso en ensayos de inmunofluorescencia. Los portaobjetos se fijaron y congelaron a -70 °C en presencia de desecante. Los portaobjetos congelados y fijos de esquizontes de P. vivax se descongelaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los portaobjetos se bloquearon con BSA al 5% en PBS durante 30 min a 37 °C. Los portaobjetos se incubaron con sueros de ratón inmunizados con PvDBPII diluidos en BSA al 2,5% a 1:500 durante 30 minutos a 37 °C, seguido de tres lavados con PBS. Se agregó una mezcla de anticuerpos secundarios IgG (H+L) anti-ratón de cabra conjugados con Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) a 1:500 y solución Hoechst 33342 (Molecular Probes) a 1:20,000 y se incubó durante 30 min a 37°. C. Después del lavado, los portaobjetos se trataron con anti-Fade (Molecular Probes) y se visualizaron en un microscopio Leica DM 5000B (Leica Microsystems).

El análisis de datos se realizó utilizando GraphPad Prism versión 9.3.1 (GraphPad Software Inc.). Las constantes de afinidad de la unión de DARC a PvDBPII SalI y PvW1 se utilizaron la prueba de Mann-Whitney. Se realizaron comparaciones por pares con las pruebas de comparaciones múltiples de Bonferroni para los resultados obtenidos en el ensayo de unión a DARC, ELISA, avidez y ensayo de inhibición de unión. Las correlaciones entre avidez, anticuerpos y títulos inhibidores para PvDBPII SalI y PvW1 se determinaron mediante la prueba de rango de Spearman. Todas las pruebas estadísticas fueron bilaterales y un valor de p <0,05 se consideró significativo.

Se recolectaron muestras de sangre periférica humana de voluntarios sanos a través de la plataforma ICAReB (Clinical Investigation & Access to Research Bioresources) del Centro de Ciencias Traslacionales, Institut Pasteur22. Todos los participantes recibieron información oral y escrita sobre la investigación y dieron su consentimiento informado por escrito en el marco de la cohorte de voluntarios sanos Diagmicoll (ensayos clínicos NCT 03912246) después de la aprobación del Comité de Ética del CPP Ile-de-France I (30 de abril de 2009). y cohorte CoSImmGEn (ensayos clínicos NCT 03925272), tras la aprobación del Comité de Ética del CPP Ile-de-France I (18 de enero de 2011)). Todos los procedimientos se llevaron a cabo en estricta conformidad con las directrices y regulaciones pertinentes.

Los estudios con animales se llevaron a cabo estrictamente de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio del Instituto Pasteur (http://webcampus.pasteur.fr/jcms/c_283578/procedures-approuvees-par-le-comite -d-ethique) y cumplió con las directrices de la Unión Europea para el manejo de animales de laboratorio (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) y las directrices ARRIVE. Los procedimientos utilizados fueron aprobados por el comité de cuidado y uso de animales del Institut Pasteur. El cuidado y manejo de los animales fue aprobado por el Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation (Ref. APAFIS 8845-2017122117082418v3). Todos los experimentos con animales fueron planificados y ejecutados para minimizar el sufrimiento animal.

Ambas proteínas recombinantes PvDBPII se expresaron en E. coli como se describió anteriormente9,10,11,12. El análisis SDS-PAGE mostró que tanto PvDBPII SalI como PvW1 recombinantes migran con un peso molecular aparente de 39 kDa, como se esperaba, y la banda monomérica de PvDBPII revela una pureza de más del 95 % en comparación con los estándares de BSA (5 μg de PvDBPII monomérico). SalI y PvW1 no mostraron otras bandas con intensidad similar al estándar BSA de 0,25 μg, figuras complementarias S1A, S2B). El análisis en geles SDS-PAGE revela que tanto PvDBPII SalI como PvW1 migran con movilidades ligeramente diferentes en condiciones no reductoras (NR) y reductoras (R) (Figuras complementarias S1B, S2C). El cambio en la movilidad indica la formación de enlaces disulfuro. PvDBPII SalI y PvW1 fueron reconocidos mediante transferencia Western utilizando anticuerpos anti-etiqueta 6xHis, que reconocieron las etiquetas 6xHis C-terminales en ambos antígenos del parásito (Figuras complementarias S1B, S2C).

La secuencia PvW1 obtenida de un aislado tailandés19 contiene 10 polimorfismos, incluida una inserción de leucina entre las posiciones 429 y 430 de la secuencia SalI (Fig. 1A). El mapeo de estos polimorfismos en la estructura de PvDBPII obtenido por Batchelor et al.23 muestra que no corresponden a los residuos en PvDBPII que son esenciales para la unión a DARC21,24 (Fig. 1B). De hecho, el PvW1 recombinante se une a los glóbulos rojos Duffy positivos (Fy+) pero no a los Duffy negativos (Fy-) (Fig. 2A, Fig. Suplementaria S2A). Además, se demostró que la unión de PvDBPII a DARC depende en gran medida de la sulfatación del residuo de tirosina 41 (Y41) de DARC25. Un DARC soluble con Y41 sulfatado es capaz de bloquear la interacción de PvDBPII con los glóbulos rojos25. Además, cuando este residuo de tirosina se sustituye por una fenilalanina (ausencia de Y41 sulfatado) la interacción DARC-PvDBPII se ve fuertemente perjudicada25. Como en el caso de PvDBPII SalI, la unión de PvDBPII PvW1 a DARC también depende de la sulfatación de Y41 en DARC (Fig. 2B). La unión de PvDBPII SalI y PvW1 recombinantes en la concentración más alta probada (25 ng/ml) fue significativamente mayor para nDARC(Y)-Fc en comparación con nDARC(F)-Fc, pero no se observaron diferencias en la unión entre las dos variantes de PvDBPII (Fig. .2C).

Polimorfismos y residuos de unión en PvDBPII SalI y PvW1. (A) Se muestran los residuos de unión que permanecen conservados (azul) y los polimorfismos (rojo) entre PvDBPII SalI y PvW1. (B) Se muestran la estructura de PvDBPII SalI (verde), incluidos los residuos de unión (azul) y los polimorfismos de PvW1 (rojo). La inserción de leucina entre las posiciones 429 y 430 en la secuencia SalI se indica con una flecha discontinua. Los extremos amino y carboxilo de PvDBPII se indican con N y C, respectivamente. Las estructuras se obtuvieron de la estructura 4NUV del Protein Data Bank (PDB) y se modificaron utilizando el software PyMOL versión 1.2.

Unión de las variantes recombinantes de PvDBPII SalI y PvW1 a DARC. (A) La unión a eritrocitos Duffy positivos (Fy+) o Duffy negativos (Fy-) de las variantes recombinantes de PvDBPII SalI y PvW1 se detectó mediante transferencia Western. Se utilizó un ensayo de unión de eritrocitos sin proteína recombinante como control negativo (N). (B,C) Unión a nDARC(Y)-Fc y nDARC(F)-Fc de PvDBPII SalI y PvW1 en diferentes concentraciones (B) y a 25 ng/ml (C). Se muestran las medias y la DE. Valores de p **p < 0,01, ***p < 0,001, comparaciones por pares con las pruebas de comparación múltiple de Bonferroni. (D) Cinética de unión de PvDBPII SalI y PvW1 a nDARC(Y)-Fc por BLI. Se probaron diferentes concentraciones de dominios PvDBPII que oscilaban entre 1 y 120 nM para unir nDARC(Y)-Fc. La constante de afinidad, KD, se calculó ajustando los perfiles de asociación/disociación con un modelo de unión 1:2 y realizando un análisis de estado estacionario. Se realizaron dos experimentos independientes y se promedió y reportó la KD para cada proteína PvDBPII ± SD.

Finalmente, BLI determinó las constantes de unión de PvDBPII SalI y PvW1 a nDARC (Y) -Fc (Fig. 2D). Las constantes de afinidad para la interacción de PvDBPII SalI y PvW1 con nDARC(Y)-Fc fueron similares sin diferencias estadísticamente significativas en los valores de KD (KD para SalI fue de 8,8 ± 0,2 nM y KD para PvW1 fue de 12,0 ± 0,3 nM, prueba de Mann-Whitney p = 0,33). Estos resultados muestran que PvDBPII SalI y PvW1 se unen con afinidades de unión similares a DARC.

Se usó PvDBPII SalI recombinante formulado con Matrix-M y GLA-SE para inmunizar ratones BALB/c como se detalla en la Fig. 3A. Se inmunizaron cinco ratones por grupo y se recogieron los sueros un día antes de cada inmunización. Los sangrados finales se recolectaron 2 semanas después del refuerzo final y las muestras de suero en cada momento se evaluaron para detectar la presencia de IgG anti-PvDBPII mediante ELISA (Fig. 3B). Las señales de OD450 en los grupos GLA-SE y Matrix-M aumentaron después de cada inmunización, aunque el aumento después del segundo refuerzo no alcanzó significación (Fig. 3B). La DO450 en el día - 1 fue inferior a 0,1 para todos los ratones. Se analizaron muestras de suero el día 70 para determinar el reconocimiento de ambas variantes de PvDBPII, SalI y PvW1 (Fig. 3C). Ambos grupos de adyuvantes mostraron títulos de reconocimiento similares para SalI y PvW1, lo que indica que Matrix-M y GLA-SE provocaron respuestas de anticuerpos específicas de PvDBPII comparables y estos anticuerpos pueden reconocer igualmente ambas variantes de PvDBPII.

Los anticuerpos anti-PvDBPII producidos en ratones pueden reconocer tanto SalI como PvW1. (A) Esquema de inmunizaciones de ratones con PvDBPII. Cinco ratones recibieron PvDBPII SalI formulado con Matrix-M o GLA-SE en los días 0, 28 y 56. Se recogieron sueros de ratones en los días - 1, 27, 55 y 70. Las imágenes se generaron en el portal en línea Biorender (B). Se midió la cinética de anticuerpos. por ELISA durante el transcurso de las vacunaciones. Se muestra la mediana de OD450 en una dilución 1:50.000 de cada grupo de ratones, incluido el rango. (C) Títulos de anticuerpos informados como concentraciones efectivas (CE50) que pueden reconocer PvDBPII SalI y PvW1 en ambos grupos de ratones. Se muestran la mediana y el rango.

Se analizaron muestras de suero del día 70 para determinar el reconocimiento de PvDBP nativo en parásitos P. vivax mediante IFA. Los cinco ratones en ambos grupos de adyuvante mostraron tinción apical correspondiente a la localización conocida de PvDBP en micronemas (Fig. 4). La incubación de esquizontes de P. vivax con sueros de ratones inmunizados con formulaciones Matrix-M y GLA-SE de PvDBPII mostró patrones e intensidad de señal de fluorescencia similares. Un conjunto con sueros de ratón el día - 1 (sin tratamiento previo) no mostró reactividad.

Reactividad de sueros de ratón con esquizontes de P. vivax de pacientes infectados con malaria por P. vivax. Imágenes representativas de esquizontes de P. vivax incubados con sueros de ratones inmunizados con PvDBPII formulado con GLA-SE y ratones inmunizados con PvDBPII formulado con Matrix-M que muestran la tinción apical de merozoitos (verde) en esquizontes maduros de P. vivax en comparación con un grupo de ratones sueros en el día - 1 (ingenuo). Este aislado clínico contiene 3 mutaciones en la secuencia PvDBP RII en comparación con la secuencia de referencia Sal1: R263S, D339G y R345H.

A continuación, se analizaron los anticuerpos anti-PvDBPII recolectados el día 70 de ratones inmunizados con PvDBPII formulado con Matrix-M y GLA-SE para determinar la avidez, el isotipado y la inhibición de la unión de PvDBPII-DARC. La avidez fue similar para ambos grupos de adyuvantes sin diferencias estadísticamente significativas entre las variantes SalI y PvW1 o entre adyuvantes (Fig. 5A). También se analizaron muestras de suero para determinar la inhibición de la interacción PvDBPII-DARC en un ensayo de inhibición de unión. Ambos grupos de adyuvante provocaron respuestas de anticuerpos inhibidores de la unión de PvDBPII-DARC (Fig. 5B). No se encontraron diferencias entre los dos grupos de adyuvantes y la unión a DARC se bloqueó en niveles similares para las variantes PvDBPII SalI y PvW1. Estos resultados demuestran que la inmunización con PvDBPII formulado con Matrix-M y GLA-SE puede provocar títulos inhibidores de la unión que pueden bloquear la unión a DARC del dominio SalI homólogo, así como de la variante heteróloga PvW1 con una eficacia similar. Además, los títulos de avidez y de inhibición de la unión, así como los títulos de anticuerpos, se correlacionan positivamente entre las dos variantes de PvDBPII (Fig. 6).

Caracterización funcional de anticuerpos anti-PvDBPII. (A) La avidez de los anticuerpos específicos de PvDBPII el día 70 se produjo en los grupos de adyuvantes GLA-SE y Matrix-M para PvDBPII SalI y PvW1. (B) Títulos inhibidores de unión el día 70 que bloquean la interacción entre DARC y PvDBPII SalI y PvW1. (C) Isotipos de anticuerpos generados contra PvDBPII para cada grupo de adyuvante. (A – C) Se muestran la mediana y el rango.

Correlaciones de propiedades funcionales entre PvDBPII SalI y PvW1. Los títulos de anticuerpos específicos de PvW1, los títulos inhibidores de la unión y la avidez están asociados con las respuestas de PvDBPII SalI. Se muestran el coeficiente de correlación de rangos de Spearman y los valores p.

Finalmente, el perfil de las respuestas de los anticuerpos se determinó mediante isotipado. Se observó el siguiente predominio relativo para isotipo/subclase: IgG1 = IgG2a > IgG2b > IgG3 > IgA = IgM, en ambos grupos de adyuvante (Fig. 5C). Por lo tanto, encontramos que se obtuvo un perfil de anticuerpos similar después de la inmunización con las formulaciones Matrix-M y GLA-SE de PvDBPII.

Los adyuvantes y las formulaciones suelen probarse en estudios preclínicos y clínicos iniciales durante el desarrollo de la vacuna. La principal vacuna candidata contra P. vivax, PvDBPII, formulada con GLA-SE, demostró ser segura e inmunogénica en un ensayo clínico de fase 1 de aumento de dosis14. Al mismo tiempo, se demostró que el adyuvante a base de saponina, Matrix-M, confiere excelentes perfiles de seguridad e inmunogenicidad en estudios preclínicos y clínicos con otras vacunas contra la malaria. Una vacuna recombinante contra la malaria por P. falciparum R21 basada en la fusión del antígeno PfCSP con HBsAg, el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, formulada con Matrix-M, arrojó niveles prometedores de eficacia contra la malaria por P. falciparum en ensayos de provocación seguidos de ensayos de eficacia en niños. en el campo26. Una vacuna similar contra la malaria por P. vivax, Rv21, compuesta de PvCSP fusionada con HBsAg provocó protección en modelos preclínicos de ratón contra la exposición a esporozoitos transgénicos de P. berghei que expresan PvCSP18. Aquí, exploramos la viabilidad de formular PvDBPII SalI con Matrix-M en un modelo de ratón preclínico y comparamos la inmunogenicidad con la formulación GLA-SE. Hemos examinado la capacidad de los anticuerpos provocados por la inmunización con formulaciones Matrix-M y GLA-SE de PvDBPII SalI para inhibir la unión al receptor tanto por el alelo homólogo SalI como por el heterólogo PvW1 del aislado de P. vivax utilizado para ensayos de provocación en etapa sanguínea.

GLA-SE es un agonista sintético del receptor tipo Toll 4 (TLR4), que induce la producción de citocinas proinflamatorias y estimula las células presentadoras de antígenos, como las células dendríticas27,28. En el caso de Matrix-M, no se ha identificado ningún receptor específico, incluido el TLR. La formulación de un antígeno polisacárido con otro extracto de QS, QS-21, provocó títulos elevados de anticuerpos en ratones transgénicos defectuosos en la señalización de TLR429, lo que sugiere que los extractos de QS pueden tener mecanismos desconocidos para activar las respuestas inmunes innatas. Matrix-M, como extracto de saponina formulado como QS-21, puede tener de manera similar mecanismos alternativos para activar la inmunidad innata del huésped y, por lo tanto, respaldar respuestas de anticuerpos con títulos altos. Aun así, se han encontrado similitudes importantes entre ambos adyuvantes, como el reclutamiento hacia los ganglios linfáticos de drenaje de células dendríticas que expresan MHC clase II y que regulan positivamente las moléculas coestimuladoras30,31. Independientemente de los diferentes receptores inmunes desencadenados por GLA-SE o Matrix-M, hemos observado una gran similitud en las respuestas de anticuerpos provocadas contra PvDBPII. Después de la inmunización con PvDBPII con cualquiera de los adyuvantes, los niveles de anticuerpos aumentaron igualmente durante el ciclo de inmunización alcanzando valores de CE50 similares el día 70. Los anticuerpos específicos de PvDBPII generados por las formulaciones GLA-SE y Matrix-M reconocen la PvDBP nativa en los esquizontes de P. vivax. . Además, estos anticuerpos específicos de PvDBPII mostraron una avidez y valores de IC50 comparables para la inhibición de la unión de PvDBPII-DARC. Aunque en este estudio no se analizaron respuestas inmunes celulares, los isotipos y subclases de anticuerpos tuvieron el mismo predominio en ambos grupos de ratones, lo que indica que es probable que ambos adyuvantes induzcan procesos celulares similares relacionados con Fc. A partir de nuestros resultados, llegamos a la conclusión de que ambos adyuvantes provocan respuestas de anticuerpos comparables después de la vacunación con PvDBPII en ratones. Por lo tanto, PvDBPII formulado con Matrix-M puede exhibir una inmunogenicidad similar a la observada anteriormente con la formulación GLA-SE en humanos.

En este estudio, evaluamos las respuestas de anticuerpos provocadas por la inmunización con PvDBPII SalI para el reconocimiento y la inhibición de la unión por la variante PvDBPII PvW119 altamente divergente. El PvW1 recombinante mostró especificidad de unión a los eritrocitos Fy+ y al DARC recombinante sulfatado con Y41 como se observó previamente9,25. Además, las constantes de afinidad, KD, para la unión de DARC recombinante a PvDBPII SalI y PvW1 fueron similares. Los polimorfismos presentes en PvW1 del aislado de P. vivax utilizado para la exposición al estadio sanguíneo se encuentran con frecuencia en múltiples aislados tailandeses de P. vivax32. Según nuestros resultados, la inmunización con PvDBPII en ratones con GLA-SE y Matrix-M genera anticuerpos que son capaces de reconocer e inhibir la unión a DARC tanto por SalI como por PvW1 con una eficiencia similar. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en el título de reconocimiento ELISA, el título inhibidor de la unión o la avidez de los anticuerpos anti-PvDBPII para los alelos SalI y PvW1. Además, se encontraron correlaciones positivas significativas en estas 3 mediciones para las dos variantes de PvDBPII, lo que sugiere que la inmunización con PvDBPII SalI puede provocar anticuerpos que trascienden la cepa. Curiosamente, los polimorfismos de PvW1 no corresponden a residuos de unión a DARC esenciales, lo que indica que los anticuerpos dirigidos a los residuos de unión deberían tener reactividad cruzada y ser capaces de neutralizar diversas variantes. Se necesitan más estudios para identificar los epítopos de PvDBPII reconocidos por los anticuerpos inhibidores.

En resumen, hemos demostrado que PvDBPII formulado con GLA-SE y Matrix-M provoca respuestas de anticuerpos similares en ratones. Estos resultados sugieren que Matrix-M podría usarse para la formulación de PvDBPII. Es importante destacar que la inhibición de la unión a DARC de PvW1 también indica que los anticuerpos específicos de PvDBPII pueden bloquear potencialmente la invasión de la cepa PvW1 de P. vivax que se utiliza para ensayos de provocación en etapa sanguínea con P. vivax19. De hecho, se probó la eficacia de PvDBPII/Matrix-M en un ensayo de exposición y se descubrió que provocaba respuestas inmunitarias que reducían la tasa de multiplicación de parásitos de la cepa de exposición heteróloga PvW1 en un 53 % en comparación con los controles no vacunados33. Esta es la mayor reducción en la tasa de multiplicación de parásitos lograda por una vacuna contra la malaria en etapa sanguínea34,35,36,37,38,39. La combinación de múltiples antígenos es un enfoque atractivo para aumentar la eficacia de la vacuna. Como se muestra en el modelo de infección de roedores con P. yoelii, la coadministración del antígeno de superficie del merozoito 1 de P. yoelii (PyMSP1) y el antígeno preeritrocítico PyCSP produce un mayor retraso en la parasitemia patente después del esporozoito. desafío en comparación con la inmunización con PyCSP solo40. De manera similar, la combinación de una vacuna basada en PvCSP y PvDBPII podría mejorar sinérgicamente la eficacia de la vacuna en humanos.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Los autores agradecen a los voluntarios que donaron sangre para el estudio. Agradecen a ICAReB-Clin del CTS (Centro de Ciencias Traslacionales) y ICAReB-biobanco del CRBIP (Centro de BioRecursos del Instituto Pasteur) por proporcionar muestras de sangre, Hélène Laude, Laurence Arowas, Blanca Liliana Perlaza, Ayla Zayoud y Marie Noelle Ungeheuer , por gestionar las visitas de los participantes y Emmanuel Roux, Remy Artus, Dorian Cheval, Sophie Vacant, Marine Samson, por preparar las muestras de sangre de los donantes. El laboratorio de CEC cuenta con el apoyo de subvenciones de la Agence Nationale de la Recherche, VIPeRs (ANR-18-CE15-0026), PvINV (ANR-21-CE15-0013) y Laboratoire d'Excellence (LabEx) “Alianza Francesa de Parasitología para la Atención Médica ”(ANR-11-LABX-0024-PARAFRAP) además de la financiación básica del Institut Pasteur. FJM recibió el apoyo de una beca de la Ecole Doctorale BioSPC (ED562), F-75006, Université Paris Cité. JP cuenta con el apoyo de una subvención R01 de los NIH (R01AI175134).

Unidad de Biología y Vacunas de Plasmodium, Institut Pasteur, Université Paris Cité, 25-28 Rue du Dr. Roux, 75015, París, Francia

Francisco J. Martínez, Micheline Guillotte-Blisnick, Christèle Huon y Chetan E. Chitnis

Plataforma de Biofísica Molecular, CNRS UMR 3528, Instituto Pasteur, Universidad Paris Cité, París, Francia

patricio inglaterra

Unidad de Investigación sobre la Malaria, Institut Pasteur du Cambodge, Phnom Penh, Camboya

Jean Popovich

Servicio clínico de investigación y acceso a recursos biológicos de investigación (ICAReB), Instituto Pasteur, París, Francia

Hélène Laude, Laurence Arowas y Marie-Noëlle Ungeheuer

Novavax AB, Kungsgatan 109, 753 18, Uppsala, Suecia

Jenny Reimer

HDT Bio, Seattle, WA, EE. UU.

Darrick Carter y Steve Reed

PAI Life Sciences Inc., Seattle, WA, EE. UU.

Darrick Carter

Programa de Desarrollo de Vacunas Múltiples, Campus ICGEB, Nueva Delhi, India

Paushali Mukherjee

Centro Internacional de Ingeniería Genética y Biotecnología (ICGEB), Nueva Delhi, India

Virander S. Chauhan

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FJM expresó proteínas recombinantes, realizó los ensayos, analizó los datos y escribió el manuscrito. MGB realizó inmunoensayos. CH expresó proteínas recombinantes. PE supervisó y analizó los experimentos. JP proporcionó portaobjetos IFA de P. vivax y determinó secuencias PvDBPII de aislados clínicos. HL, LA y MNU proporcionaron muestras de sangre y realizaron ensayos de control de calidad. JMR proporcionó adyuvante Matrix-M. DC, SR proporcionó adyuvante GLA-SE. PM y VSC participaron en el desarrollo de vacunas y la gestión de proyectos. CEC diseñó el estudio y escribió el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito y estuvieron de acuerdo con la versión final.

Correspondencia a Chetan E. Chitnis.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Martínez, FJ, Guillotte-Blisnick, M., Huon, C. et al. Inmunogenicidad de una vacuna de Plasmodium vivax basada en la proteína de unión duffy formulada con adyuvantes compatibles para su uso en humanos. Informe científico 13, 13904 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40043-6

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Recibido: 02 de mayo de 2023

Aceptado: 03 de agosto de 2023

Publicado: 25 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40043-6

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