Influencia del sulfuro en el crecimiento diazotrófico del metanógeno Methanococcus maripaludis y sus implicaciones para el origen de la nitrogenasa.

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 799 (2023) Citar este artículo

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Los metanógenos habitan en ambientes euxínicos (ricos en sulfuros) o ferruginosos (ricos en hierro) que promueven la precipitación de metales de transición como sulfuros metálicos, como la pirita, lo que reduce la disponibilidad de metales o azufre. Estos entornos han sido comunes a lo largo de la historia de la Tierra, lo que plantea la cuestión de cómo los anaerobios obtienen estos elementos para la síntesis de cofactores enzimáticos. Aquí, mostramos que un metanógeno puede sintetizar metalocofactores de molibdeno nitrogenasa a partir de pirita como fuente de hierro y azufre, lo que permite la fijación de nitrógeno. Las células fijadoras de nitrógeno cultivadas con pirita crecen más rápido y requieren 25 veces menos molibdeno que las células cultivadas en condiciones euxínicas. Los rendimientos de crecimiento son de 3 a 8 veces mayores en cultivos cultivados en condiciones ferruginosas que en condiciones euxínicas. Los datos fisiológicos, transcriptómicos y geoquímicos indican que estas observaciones se deben a la limitación del metal promovido por sulfuro, en particular el molibdeno. Estos hallazgos sugieren que la nitrógenoasa de molibdeno puede haberse originado en un ambiente ferruginoso que valoraba el sulfuro para formar pirita, facilitando la disponibilidad de suficiente hierro, azufre y molibdeno para la biosíntesis del cofactor.

El nitrógeno (N) es esencial para la síntesis de ácidos nucleicos y aminoácidos y otras biomoléculas clave en todas las formas de vida. La mayor reserva de N de la Tierra es el gas dinitrógeno (N2) en la atmósfera; sin embargo, no es biodisponible y debe fijarse en nitrato (NO3-) o amoniaco (NH3) antes de su asimilación. Como tal, la disponibilidad de N fijo a menudo limita la productividad de los ecosistemas1. Se cree que en la Tierra primitiva, el N fijo fue suministrado por procesos abióticos como la oxidación del N2 atmosférico provocada por rayos o la reducción mineral de N22,3. Sin embargo, el N fijo de estas fuentes habría sido mínimo y finito, y se cree que en conjunto estas características han limitado la productividad del ecosistema durante este tiempo1. Hoy en día, aproximadamente el 50 % de todo el N fijado se genera mediante el proceso biológico de fijación de N21,4, mediante el cual el N2 se reduce a NH3 mediante la enzima nitrogenasa (diazotrofia) y el N fijo restante se genera en gran medida mediante el proceso industrial de Haber-Bosch.

Hasta la fecha se han descrito tres formas diferentes de nitrogenasa y se diferencian por los (hetero)metales que comprenden el sitio activo de cada complejo enzimático5. Esto incluye formas de nitrógenoasa exclusivamente de molibdeno (Mo), vanadio (V) y hierro (Fe)6,7. La mo-nitrogenasa (Nif) es taxonómicamente la forma más antigua y ampliamente distribuida de nitrogenasa8,9 y, como mínimo, consta de las proteínas estructurales NifHDK y las proteínas madurasas, NifB(E)N10. El metalocluster del sitio activo de Nif comprende un núcleo de seis átomos de hierro (Fe) y nueve de azufre (S), con Fe coordinando simétricamente un átomo de carbono central; el metalocluster está cubierto por átomos de Fe y Mo [7Fe-Mo-9S] (denominado cofactor FeMo10,11). Además del cofactor(es) FeMo, Nif requiere el complejo grupo P que consta de ocho átomos de Fe y siete átomos de S [8Fe-7S]12. Un cofactor FeMo se aloja dentro de cada proteína estructural NifD, mientras que el grupo P se encuentra en la interfaz de cada NifD y NifK, formando finalmente el heterotetrámero, NifD2K213. La dinitrogenasa reductasa, NifH, modula la transferencia de electrones dependiente de ATP a NifD2K2 y alberga un grupo [4Fe-4S] adicional para cada una de las dos subunidades de NifH14,15. Por lo tanto, las células que realizan la fijación de N2 a través de Nif tienen una alta demanda de Fe, S, Mo, ATP y equivalentes reductores.

Los análisis filogenéticos de una concatenación de proteínas NifHDK indican que los primeros linajes evolutivos de Nif se encuentran en metanógenos hidrogenotróficos6,7,8,9,16,17. Estas observaciones están corroboradas por otros datos que indican que NifHDK evolucionó a partir de una serie de duplicaciones de genes que codifican un ancestro de CfbCD8, proteínas necesarias para sintetizar el cofactor F43018,19. El hecho de que F430 (y los genes que codifican CfbCD) se encuentren exclusivamente en metanógenos de arqueas (y alcanotrofos de arqueas)20 es una evidencia más que indica un origen de Nif entre los ancestros de estas arqueas. Estos datos se han utilizado para sugerir un origen de Nif entre un ancestro de los metanógenos anaeróbicos durante el Paleoproterozoico medio hace ~1.800-2.100 millones de años (Ga)6,9,17, aunque los datos isotópicos de materia orgánica conservados en lutitas datan de > 3 Ga sugieren un origen incluso anterior21,22. Independientemente de la fecha real de su origen, se interpreta que la nitrogenasa es una enzima antigua que se originó en un ambiente anóxico en la Tierra primitiva. Un origen anóxico para esta enzima es consistente con la sensibilidad al oxígeno de los grupos metálicos necesarios para la función Nif23. Luego, el Nif se diversificó entre los anaerobios y sólo al final de su historia evolutiva se adquirió mediante transferencia horizontal de genes entre organismos capaces de integrar oxígeno (O2) en su metabolismo energético o capaces de producir O2 en el caso de las cianobacterias. La productividad biológica ampliada asociada con la proliferación de cianobacterias y la producción de O2 habría aumentado la demanda de reservas abióticas existentes de N24 fijo, lo que puede haber sido la presión selectiva para desarrollar un mecanismo biológico para reducir el N2 atmosférico y aliviar la limitación de N7,25.

Las condiciones ferruginosas (anóxicas y ricas en hierro ferroso (Fe (II))) probablemente dominaron los ambientes anóxicos durante el Arcaico (>2.4 Ga)26,27. Esto se debe a la circulación de fluidos hidrotermales a través de basaltos oceánicos ricos en hierro, lo que provocó la entrada de una mayor cantidad de Fe (II) en aguas anóxicas de la cuenca oceánica que de sulfuro (HS-)28. En ausencia de oxígeno, el exceso de Fe(II) habría sido estable y se estima que las concentraciones de Fe(II) libre oscilaron entre 0,05 y 0,5 mM29. Sin embargo, la proliferación de cianobacterias y la producción de O2 durante el Arcaico tardío impulsaron la erosión oxidativa de los minerales de sulfuro continentales que aumentaron el flujo de sulfato hacia los océanos. Cuando se combina con una mayor productividad cerca de los márgenes del océano30,31, esto habría estimulado la reducción de sulfatos heterótrofos y la producción de HS. A su vez, esto condujo a océanos costeros estratificados que estaban oxigenados en la superficie y eran euxínicos (anóxicos y ricos en HS) en profundidad30,31,32. En contraste, las aguas oceánicas más profundas y aquellas más distales de los márgenes continentales permanecieron ferruginosas26, debido a una menor productividad en la columna de agua suprayacente, una menor disponibilidad de sulfato y la posterior reducción heterótrofa de sulfato, y el aporte hidrotermal de Fe26,33,34. HS- tiene una alta afinidad por el Fe (II), lo que resulta en la formación de minerales de sulfuro de hierro de baja solubilidad, incluida la pirita (FeS2) 35,36,37. Como tal, en ambientes euxínicos, las concentraciones de HS- exceden las de Fe(II), lo que resulta en la titulación y precipitación de Fe(II) como FeS2. En estas condiciones, el exceso de HS- también está disponible para formar complejos con otros metales tiófilos (p. ej., Mo, Co, Ni), lo que potencialmente los vuelve menos biodisponibles33,34,38.

¿Cómo podrían los metanógenos fijadores de N2 haber satisfecho sus demandas simultáneas de Fe, S y Mo para la síntesis de cofactores Nif durante el Paleoproterozoico o incluso antes, cuando uno o más de estos elementos probablemente tenían una disponibilidad limitada debido a la tendencia a la degradación? formación de sulfuro metálico? Pistas potenciales provienen de estudios recientes de metanógenos contemporáneos, específicamente Methanococcus voltae y Methanosarcina barkeri, que revelan su capacidad para disolver de forma reductiva FeS2 y utilizar productos de disolución para satisfacer las demandas nutricionales de Fe y S39,40,41. M. voltae y M. barkeri cultivadas con FeS2 tuvieron tasas de crecimiento y rendimientos celulares similares en comparación con las fuentes tradicionales de Fe y S utilizadas para cultivar metanógenos (Fe(II) y HS- y/o cisteína)39,40. Sin embargo, estos experimentos se realizaron en células metanógenas que no fijan N2, de las que se esperaría que tuvieran una menor demanda de Fe, S y Mo que las que fijan activamente N2, en particular las que crecen con Mo-nitrogenasa. Tales observaciones apuntan a que las condiciones ferruginosas son posiblemente más favorables que las condiciones euxínicas para el origen y la proliferación temprana de Nif.

Aquí, intentamos evaluar el efecto de las condiciones euxínicas y ferruginosas sobre el crecimiento y la actividad del metanógeno, Methanococcus maripaludis S2 (MmS2), para proporcionar nuevos conocimientos sobre el tipo de entorno más propicio para el origen de Nif. Las células se cultivaron primero con Fe (II) y HS o FeS2 como fuente primaria de Fe y S en condiciones de fijación de N2 o modificadas con NH3, para establecer si el FeS2 podría servir como fuente de Fe y S para la biosíntesis de la nitrogenasa y para determinar si HS- impulsa la limitación de Mo. Luego, los ensayos de cultivo se centraron en células cultivadas con FeS2, ya que esta condición permite que se incluya un exceso de Fe (II) o HS- en el medio de cultivo, lo que permite una evaluación del efecto de las condiciones ferruginosas o euxínicas, respectivamente, sobre la disponibilidad de metales y Actividad de fijación de N2. Nif es la única nitrogenasa codificada en MmS242, lo que mitiga la variable de confusión asociada con el cambio de células a formas alternativas y evolucionadas más recientemente de nitrogenasa (es decir, Fe-nitrogenasa Anf; V-nitrogenasa, Vnf9) si, o cuando, Mo se vuelve limitante5,43 . Además, el Nif codificado por MmS2 pertenece al linaje de nitrogenasa en evolución más temprana6,8,9,16. Para imponer demandas adicionales de Mo a MmS2, las células se cultivaron con formiato, lo que requirió la expresión de la formiato deshidrogenasa que contiene molibdopterina44,45 y la formilmetanofuranodeshidrogenasa dependiente de Mo o tungsteno (W) (Fmd y Fwd, respectivamente)46,47. Los resultados se discuten en relación con la posible condición ambiental (es decir, euxínica o ferruginosa) que habría permitido que la enzima Nif sensible al O2 evolucionara y funcionara en un metanógeno y, en última instancia, en otros anaerobios, en los hábitats anóxicos de las épocas temprana y actual. día Tierra.

MmS2 creció en condiciones de crecimiento fijadoras y no fijadoras de N2 (modificadas por NH3) cuando se proporcionaron nanopartículas sintéticas FeS2 o Fe(II)/HS- como únicas fuentes de Fe/S y con formiato como donante de electrones y metanogénesis. sustrato (Fig. 1a – d). El crecimiento no se produjo en cultivos a los que no se les proporcionó una fuente de Fe/S, independientemente de si las células recibieron N2 o NH3. Del mismo modo, los cultivos cultivados en ausencia de NH3 y bajo un espacio libre de argón (Ar) no crecieron, independientemente de la fuente de Fe/S proporcionada (Fig. 1a, c). Es importante destacar que MmS2 también pudo crecer en condiciones de fijación de N2 con una muestra (tamaño de grano de 63 a 150 µm) de FeS2, lo que indica que una forma natural (no sintetizada en laboratorio) de FeS2 proporciona Fe y S durante la fijación de N2 (Fig. 1a, b). Los recuentos celulares y las mediciones de CH4 se realizaron con poca frecuencia en cultivos con muestras de FeS2, ya que los experimentos preliminares demostraron que eran sensibles a las perturbaciones mecánicas. Esto puede estar relacionado con las diferentes geometrías de las nanopartículas sintéticas de FeS2 que se componen de pequeños framboides con una gran superficie en comparación con las facies grandes y planas del espécimen mayormente cúbico de FeS2, lo que podría afectar la capacidad de las células para unirse (Figura complementaria). 1). No obstante, estos datos indican que tanto las formas sintéticas como naturales de FeS2 pueden servir como única fuente de Fe/S en las células MmS2 fijadoras de N2.

El crecimiento y la actividad se controlaron cuantificando la densidad celular (a, b) y la producción de metano (c, d) a lo largo del tiempo, respectivamente. Los paneles a y b y los paneles cy d se trazan utilizando los mismos ejes y, respectivamente. Los datos presentados son la media y la desviación estándar de tres réplicas biológicas por condición. amoniaco NH3, argón Ar, dinitrógeno N2, hierro ferroso Fe(II), metano CH4, pirita FeS2, sulfuro HS-.

El número total de células producidas en los cultivos modificados con NH3 fue mayor en relación con los cultivos fijadores de N2, independientemente de la fuente de Fe/S proporcionada (Fig. 1a, b). A pesar de las diferencias en las densidades celulares finales, los cultivos cultivados en todas las condiciones (excepto los controles negativos) produjeron cantidades similares de CH4 después de 54 h de incubación (Fig. 1c, d). Como tal, el rendimiento celular (células por mmol de CH4) en cultivos fijadores de N2 fue significativamente (p <0,01) menor que en cultivos modificados con NH3 (Figura complementaria 2). Este hallazgo es consistente con una disminución de casi tres veces en el rendimiento celular del metanógeno, Methanothermobacter thermolithotrophicus, cuando se cultiva en condiciones de fijación de N2 en comparación con las condiciones modificadas con NH348. La fuente de Fe y S proporcionada a los cultivos de MmS2 también tuvo un efecto marcado en la tasa de producción celular (Tabla complementaria 1) y el número total de células producidas para las condiciones de fijación de N2, pero tuvo un efecto mínimo en los cultivos modificados con NH3 (Fig. 1a, b). Específicamente, los cultivos fijadores de N2 provistos de FeS2 tuvieron un rendimiento celular casi tres veces mayor (p <0,01) que aquellos provistos de Fe (II)/HS- (Figura complementaria 2). A diferencia de informes anteriores que mostraban que los cultivos modificados con NH3 de M. voltae y M. barkeri (ambas cepas MS y Fusaro) lograron rendimientos celulares similares cuando se les proporcionó FeS2 o Fe(II)/HS-40,41, MmS2 cultivado con FeS2 tuvo un rendimiento un 29% menor que el de las células cultivadas con Fe(II)/HS provistas de NH3. Sin embargo, la reducción en el rendimiento celular fue aún más dramática cuando se compararon las células MmS2 fijadoras de N2, y las que recibieron Fe (II)/HS mostraron una reducción del 92% en el rendimiento en relación con las que recibieron NH3. Esto demuestra la carga energética que la fijación de N2 supone sobre las células MmS2 y la dependencia de esta de la fuente de Fe/S proporcionada.

Para comprender mejor las diferencias en la cinética de crecimiento y los rendimientos observados en cultivos de MmS2 cultivados en condiciones de fijación de N2 o modificadas con NH3 con FeS2 o Fe(II)/HS- como única fuente de Fe/S, el tamaño de las células durante el proceso de registro La fase en cada condición de crecimiento se determinó mediante microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FEM). Se encontró que el tamaño promedio de las células MmS2 era significativamente diferente (p < 0,05) para cada condición de crecimiento, donde las células modificadas con NH3 cultivadas con Fe(II)/HS- fueron las más grandes, seguidas de las células fijadoras de N2 cultivadas con Fe(II). )/HS-. Las células modificadas con NH3 cultivadas con FeS2 eran aún más pequeñas y las células fijadoras de N2 cultivadas con FeS2 fueron las más pequeñas entre todos los tratamientos (Tabla complementaria 1).

Se sugiere que el tamaño celular se correlaciona positivamente con la tasa de crecimiento celular (divisiones celulares h-1) y/o la disponibilidad de nutrientes, aunque los mecanismos reguladores del tamaño celular no se conocen bien en todos los ámbitos de la vida49,50. La “ley de crecimiento” sugiere que el tamaño celular se correlaciona positivamente con la tasa de crecimiento50; sin embargo, esto no explica los patrones observados aquí. Las células diazotróficas MmS2 cultivadas en Fe (II) / HS tuvieron el segundo tamaño más grande pero la más baja de las tasas de crecimiento observadas en las cuatro condiciones (Tabla complementaria 1). Más bien, estos resultados indican que el crecimiento sobre FeS2 imparte una mayor reducción en el tamaño celular que la fijación de N2, y que estos efectos son semiaditivos. Esto es consistente con datos recientes que sugieren que el tamaño de las células es más una función de la disponibilidad de nutrientes que de la tasa de crecimiento sola49, y las condiciones de limitación de nutrientes conducen a tamaños de células más pequeños posiblemente debido a la ventaja fisiológica de una mayor proporción de superficie a volumen para el transporte de nutrientes. a través de la membrana. Por ejemplo, se demostró que la cianobacteria marina diazotrófica, Crocosphaera watsonii, sufre una reducción de aproximadamente 2,2 veces en el volumen celular en respuesta a la limitación de Fe51. De manera similar, las células de M. voltae mostraron una reducción de ~3,2 veces en el volumen celular cuando se cultivaron en FeS2 en relación con Fe(II)/HS-39. El análisis proteómico de las células de M. voltae reveló un aumento de la expresión de las proteínas de absorción de hierro (Feo) cuando se cultivan con FeS2, lo que indica que las células pueden detectar incorrectamente la limitación de Fe (II) debido a la asimilación de Fe (II) complejado con sulfuro (FeS (aq) ), a pesar de que las células cultivadas con FeS2 tienen un mayor contenido de Fe39. En comparación, también se ha demostrado que la limitación de N conduce a una disminución del tamaño celular, con una reducción de aproximadamente 1,5 a 2,5 veces en el volumen celular en aislados de bacterioplancton heterótrofo cultivados en condiciones limitantes de N52,53. El efecto semiaditivo de las fuentes de Fe, S y N y su disponibilidad sobre el tamaño y la tasa de crecimiento de las células MmS2 sugieren que las células MmS2 están respondiendo a limitaciones reales o percibidas de uno o más de estos elementos.

Se ha demostrado que la composición isotópica de C en la biomasa y el CH4 varía con la tasa de crecimiento, la disponibilidad de sustrato y las condiciones ambientales en una variedad de cultivos metanógenos54,55,56,57,58. Para evaluar más a fondo el efecto de la disponibilidad de N y la fuente de Fe y S sobre el fenotipo de MmS2, y para confirmar la actividad de fijación de N2, se examinaron isótopos estables de C (δ13C) y N (δ15N) en CH4 y/o biomasa en cultivos cultivados bajo Condiciones de fijación de N2 o de NH3 modificadas con FeS2 o Fe(II)/HS como única fuente de Fe/S.

La biomasa de células MmS2 tenía valores de δ15N claramente diferentes cuando se cultivaba en condiciones de fijación de N2 versus condiciones modificadas de NH3 (Fig. 2a). Las células cultivadas en condiciones de fijación de N2 tuvieron valores de δ15N similares de −3,22 ± 0,14 y −3,16 ± 0,06 ‰ cuando se les proporcionó Fe (II) / HS- y FeS2, respectivamente. Estas ligeras diferencias en los valores de δ15N no son estadísticamente significativas (p = 0,55) y son similares a los valores de δ15N de −4‰ informados previamente para las cepas de Methanocaldococcus y Methanothermococcus fijadoras de N2 aisladas de respiraderos hidrotermales59. Las células MmS2 modificadas con NH3 cultivadas con Fe (II) / HS- y FeS2 tenían valores de δ15N casi idénticos de −21,63 ± 0,23 y −21,61 ± 0,47 ‰, respectivamente. Se sabe que la asimilación de NH3 por microorganismos como E. coli produce biomasa con valores de δ15N que oscilan entre −16 y −21‰ en condiciones de abundancia de NH360. La sal NH4Cl utilizada para cultivar MmS2 tenía un valor de δ15N de -3,06 ‰ (Fig. 2a); como tal, el fraccionamiento de δ15N en la biomasa estaría más cerca de ~ −18,6‰ y por lo tanto está dentro del rango de valores esperados para las células que asimilan NH3.

Se analizaron las células de fase logarítmica media (biomasa) para determinar sus relaciones de masa de carbono a nitrógeno (C/N) y sus valores de δ15N (a). También se analizaron los valores de δ13C (b) de la biomasa y el metano. La leyenda en a es la misma para b. Los datos presentados son la media y la desviación estándar de tres cultivos replicados para todas las condiciones. Los resultados de isótopos se presentan en notación delta según valores por mil (‰) frente a aire (δ15N) o VPDB (δ13C). Consulte los Datos complementarios 1 para obtener datos adicionales. Amoniaco NH3, dinitrógeno N2, hierro ferroso Fe(II), metano CH4, pirita FeS2, sulfuro HS-.

Los valores de δ13C para la biomasa de MmS2 fueron similares para todas las condiciones de crecimiento probadas (−48 a −50‰), con la excepción de la biomasa cultivada en condiciones de fijación de N2 con Fe (II)/HS- (−46‰; Fig. 2b). . Estudios anteriores han interpretado que la disminución del fraccionamiento de los isótopos de C de la biomasa en los metanógenos indica una menor renovación de los sustratos de C54, y esto es consistente con la lenta tasa de crecimiento y las bajas densidades celulares observadas en las condiciones de fijación de N2 con Fe(II)/HS-. No obstante, todos los valores de δ13C de biomasa están dentro del rango de valores de biomasa (rango −30 a −49 ‰) determinado previamente para una variedad de metanógenos cuando se cultivan con varios donantes de electrones/fuentes de carbono en una variedad de condiciones de cultivo54. Los valores de δ13C de CH4 fueron en general similares (-58 a -64‰) con la excepción de las células fijadoras de N2 provistas de Fe(II)/HS-, que eran más pesadas (-58‰) pero no significativamente diferentes (p = 0,07). ) que el de las células fijadoras de N2 cultivadas con FeS2 (−60 ‰) (Fig. 2b). Al igual que la biomasa δ13C, la δ13C del CH4 está dentro del rango de valores (-50 a -100 ‰) medidos para cultivos de metanógeno cuando se cultivan con una variedad de donantes de electrones/sustratos de metanogénesis en una variedad de condiciones de cultivo54,55,61. En conjunto, estos resultados sugieren que la fijación de N2 afecta el metabolismo energético y de carbono del MmS2, y este efecto es mayor cuando las células fijadoras de N2 reciben Fe (II)/HS- en comparación con FeS2. Esto podría deberse a la competencia por el molibdato entre las formiatos deshidrogenasas, las nitrogenasas y potencialmente las formilmetanofurano deshidrogenasas, que pueden verse amplificadas por las disminuciones promovidas por HS en la disponibilidad de Mo (que se analizan más adelante). Se esperaría que esto disminuyera la tasa de oxidación de formiato y la producción de CO2, permitiendo que el intercambio pasivo de CO2 intracelular y extracelular tuviera una mayor influencia en la composición isotópica del CH4.

Además de investigar los isótopos de C y N, se determinaron las masas de C y N y las relaciones C/N para muestras de biomasa (Fig. 2a). Las proporciones C/N fueron similares en todas las condiciones (rango de 3,4 a 3,6), excepto en las células MmS2 fijadoras de N2 cultivadas en Fe (II)/HS que tenían una proporción C/N de 4,3. Estudios anteriores han demostrado que las proporciones C/N en cultivos de bacterioplancton marino heterótrofo aumentan aproximadamente un 40% cuando se limitan a N52 fijo. Además, la relación C/N de los cultivos de Nostoc fijadores de N2 aumentó en un 80% bajo la limitación de MoO4262. La elevada relación C/N de las células MmS2 fijadoras de N2 provistas de Fe (II)/HS- (Fig. 2a), cuando se considera a la luz de los bajos rendimientos de las células en esta condición (Fig. 2 complementaria), apunta a N y /o limitación de MoO42- en estas células. Es importante destacar que las diferencias en las vías autótrofas utilizadas por los metanógenos (Wood-Ljungdahl) y los fotótrofos oxigénicos (Ciclo de Calvin) pueden influir en la partición del carbono en biomasa o CH4 y pueden influir en las relaciones C/N en la biomasa que se comparan aquí.

Se utilizó transcriptómica de escopeta para generar perfiles de expresión génica a partir de cultivos en fase logarítmica de células fijadoras de N2 y modificadas con NH3 provistas de FeS2 o Fe(II)/HS- como única fuente de Fe/S (consulte la Tabla complementaria 2 para obtener datos de crecimiento). . Luego se utilizaron las diferencias en la expresión genética para comenzar a identificar los procesos metabólicos/fisiológicos que se vieron afectados por las fuentes de N, Fe y S proporcionadas. En general, se detectaron 1737 transcripciones únicas entre los 1742 genes codificadores de proteínas codificados por MmS2 (el 99,7% de los genes tenían transcripciones detectables). El análisis de componentes principales de los perfiles de expresión génica reveló que las muestras se agruparon según las condiciones de cultivo (Figura complementaria 3). Una variedad de procesos celulares (215 genes) se regularon significativamente (p <0,05) de manera diferencial entre las células fijadoras de N2 y modificadas con NH3 cultivadas con Fe (II) / HS o FeS2 (Fig. 3a). La mayoría de los genes expresados ​​diferencialmente entre las células fijadoras de N2 y las modificadas con NH3 tuvieron valores de cambio log2 similares para condiciones Fe(II)/HS- o FeS2 (es decir, estos genes caen en una línea 1:1 en la Fig. . 3a), enfatizando además que la fijación de N2 induce una respuesta fisiológica significativa independientemente de la fuente de Fe y S. De estos genes, los implicados en la fijación de N2, el transporte de molibdeno y hierro y la unión de metales estaban significativamente regulados positivamente en condiciones de fijación de N2, independientemente de la fuente de Fe y S. Por el contrario, los genes ribosómicos, los genes implicados en la biosíntesis celular (p. ej., acetil-CoA sintasa) y la replicación del genoma (p. ej., ADN polimerasa) fueron reprimidos en condiciones de fijación de N2. Estos resultados son consistentes con menores tasas de crecimiento y rendimientos observados para las células fijadoras de N2 en comparación con las células modificadas con NH3, independientemente de la fuente de Fe y S proporcionada (Fig. 1).

a Transcripciones que se expresaron de manera significativamente diferencial (p <0,05, prueba de Wald) para la fijación de nitrógeno en relación con las células modificadas con amoníaco cuando se cultivaron en hierro ferroso y sulfuro (eje x) o pirita (eje y) mostradas en un log2 veces -cambiar escala. Los valores positivos indican una mayor expresión en condiciones de fijación de nitrógeno y los valores negativos indican una mayor expresión en condiciones modificadas con amoníaco. Se proporciona una línea discontinua gris 1:1 para facilitar las comparaciones basadas en fuentes de hierro y azufre. Se muestra la expresión de transcripción media para genes seleccionados relacionados con la fijación de nitrógeno (b) y el transporte de molibdeno (c) que están organizados en el orden en que aparecen en el genoma. Cada gen está representado por un punto codificado por colores (a) o una flecha (b, c) con etiquetas de locus designadas entre paréntesis (“MMP_RS” se ha truncado de la designación del locus para conservar espacio). Los genes están coloreados según su función en la leyenda a la derecha de cada panel. Cada punto representa la expresión normalizada media de tres réplicas de cultivo por condición de crecimiento. Diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05, prueba de Wald) en la expresión de las condiciones de fijación de nitrógeno versus condiciones modificadas con amoníaco con hierro ferroso y sulfuro (a) o pirita (b) o entre condiciones de fijación de nitrógeno cultivadas con fuente de hierro y azufre ( c) se muestran encima de cada gen para los paneles b y c. hierro ferroso Fe(II), pirita FeS2, sulfuro HS-, dinitrógeno N2, amoníaco NH3, sin significancia, ns

Los genes centrales nif están codificados en un único operón en MmS263 que está regulado transcripcionalmente por la proteína represora NrpR y 2-oxoglutarato, una señal de limitación de N64,65,66. El regulador transcripcional nif, NrpR, no se transcribió diferencialmente según la fuente de N, lo que concuerda con informes anteriores de que la actividad de este represor es independiente de sus niveles en la célula (Fig. 3b)67. Los genes que codifican los componentes estructurales centrales de Nif (nifHDK), maturasas (nifENX) y proteínas reguladoras (nifI1, nifI2) estaban regulados positivamente en células MmS2 fijadoras de N2 en relación con las células modificadas con NH3 y los patrones de su expresión fueron generalmente similares independientemente de si Las células recibieron Fe (II) / HS- o FeS2 (Fig. 3b). Un solo gen nif, nifB, queda fuera del operón nif y se encontró que se expresa de manera significativamente diferencial entre las condiciones de fijación de N2, con células cultivadas con Fe(II)/HS que tienen niveles de expresión ligeramente más bajos que las células cultivadas con FeS2. NifB es responsable del ensamblaje del precursor del cofactor FeMo, NifB-co, que luego se transfiere a NifEN donde tiene lugar la maduración final del cofactor mediante la adición de Mo y homocitrato68. No está claro por qué la expresión de NifB fue menor en condiciones de fijación de N2 en células cultivadas con Fe (II)/HS. Además de los genes nif, la expresión de la glutamina sintasa (glnA) fue elevada en las células fijadoras de N2 en relación con las células modificadas con NH3, pero esta diferencia solo fue significativa para las células cultivadas con FeS2. GlnA es una enzima importante para la asimilación de NH3 en MmS264, y la mayor expresión en células cultivadas con FeS2 fijadoras de N2 puede haber contribuido a sus relaciones C/N más bajas. En conjunto, los perfiles transcriptómicos demuestran que MmS2 regula positivamente la expresión de genes que codifican las proteínas Nif maturasa, Nif estructural y asimilación de NH3 (es decir, GlnA) cuando fijan N2 y la expresión de estos genes es generalmente similar entre las fuentes de Fe/S.

Nif es la única nitrogenasa codificada por MmS2 y esta enzima es Mo-dependiente42. Además, MmS2 codifica una formiato deshidrogenasa dependiente de Mo (Fdh)44,45 y formas de formilmetanofurano deshidrogenasa dependientes de Mo y W (Fmd y Fwd, respectivamente) que son necesarias para la metanogénesis con formiato46,47. La expresión de fdh fue en general similar entre las condiciones, con solo una subunidad que codifica el gen (fdhB; MMP_RS00800) que se reguló significativamente en condiciones modificadas con NH3 en relación con las condiciones de fijación de N2 cuando se cultivó con Fe (II) / HS- (Tabla complementaria 3). ). Curiosamente, la transcripción de fwd y fmd difirió entre las condiciones de crecimiento, con tres de siete genes fwd (MMP_RS06415-MMP_RS06425) significativamente regulados positivamente en condiciones modificadas con NH3 en relación con las condiciones de fijación de N2 en células cultivadas con Fe (II)/HS; La expresión de los genes fwd fue similar en las condiciones modificadas con NH3 en relación con las condiciones de fijación de N2 en células cultivadas con FeS2. En el caso de fmd, la expresión de un grupo completo de cinco genes fmd (MMP_RS02690-MMP_RS02710) se reguló significativamente (cambio log2 de ~1,5) en células fijadoras de N2 en relación con las condiciones modificadas por NH3 cuando se cultivaron con FeS2; Aparte de un solo gen fmdE (MMP_RS02690), las transcripciones de fmd no difirieron significativamente en las células fijadoras de N2 en relación con las células modificadas con NH3 cuando se cultivaron con Fe (II) / HS- (Tabla complementaria 3). No está claro por qué fwd se expresó al alza en condiciones modificadas con NH3 con Fe(II)/HS-, pero podría deberse a la muy alta afinidad del MoO42- por HS- y su baja solubilidad69. Esto, a su vez, aumentaría la biodisponibilidad de tungstato (WO42-) en relación con MoO42-, que cuando se combina con los mayores rendimientos de crecimiento en las condiciones modificadas con NH3 con Fe(II)/HS-, conduce a una mayor expresión de fwd. transcripciones. De manera similar, el aumento de la transcripción de genes fmd en condiciones de fijación de N2 en relación con las condiciones modificadas con NH3 en FeS2 podría indicar que Mo está más disponible en condiciones de crecimiento de FeS2, sin verse afectada la expresión de las transcripciones de fwd.

Los miembros de Archaea y Bacteria adquieren Mo en forma de MoO42, utilizando transportadores ABC específicos de MoO42 llamados Mod70. Las transcripciones de tres grupos de genes relacionados con mod codificados por MmS2 se compararon en células fijadoras de N2 y modificadas con NH3 cultivadas con FeS2 o Fe (II) / HS- (Fig. 3c). La expresión de los genes que comprenden los tres grupos de genes mod se reguló positivamente en las células fijadoras de N2 en relación con las células modificadas con NH3, independientemente de la fuente de Fe/S. Además, la expresión de genes que comprenden dos de los tres grupos de genes mod (MMP_RS01135-MMP_RS01145 y MMP_RS02670-MMP_RS02685) y un transportador anotado similar a NifC (MMP_RS08475) se reguló significativamente (p <0,05) en células fijadoras de N2 cultivadas con Fe (II). )/HS- respecto a los cultivados con FeS2. Estos resultados indican que la fijación de N2 aumenta la expresión de supuestos transportadores MoO42-, y esta expresión es mayor en las células fijadoras de N2 cultivadas con Fe (II)/HS- en comparación con aquellas cultivadas con FeS2. En conjunto, estos datos sugieren que el transporte de MoO42 está influenciado no solo por las demandas asociadas con las enzimas dependientes de Mo (Fdh, Fmd, Nif) sino también por la fuente de Fe/S. Más específicamente, los resultados sugieren una limitación de Mo en las células fijadoras de N2 cultivadas con Fe (II)/HS-, posiblemente debido a la formación de complejos de HS- y/o reacción con Mo38,71.

Un estudio previo informó que el HS- en una concentración >6 mM inhibe la fijación de N2 en los sedimentos de las corrientes72. Si bien este efecto se atribuyó a la toxicidad del HS- en las células responsables de la fijación de N2, es posible que el HS- añadido influya en la disponibilidad de trazas de metales (p. ej., Fe, Mo) necesarios para las células fijadoras de N262,73,74. 75. Un efecto similar de HS- sobre la disponibilidad de metales en cultivos de MmS2 que fijan N2 puede explicar los menores rendimientos celulares y el aumento de la expresión de genes Mod observados en células cultivadas con Fe (II)/HS en comparación con aquellas cultivadas con FeS2. MoO42- es una molécula tiófila que reacciona fácilmente con HS- para formar especies de tiomolibdato soluble (MoO4-nSn2-) que finalmente pueden incorporarse en minerales de sulfuro, como el FeS271,76. Se esperaría que tales reacciones de tiolación ocurrieran en las condiciones de cultivo sulfídicas (2 mM) utilizadas típicamente para cultivar metanógenos77 y que se utilizaron en el presente documento para los cultivos cultivados con Fe(II)/HS. Estas condiciones de cultivo euxínico limitaron potencialmente la disponibilidad de MoO42, de modo que no satisfizo las demandas celulares.

Para comenzar a examinar esta hipótesis, se rastreó la especiación del Mo en reactores abióticos que contenían un medio de sales básicas anóxicas sin NH3 ni metales añadidos. Los reactores se modificaron con varias combinaciones de HS- (2 mM), Fe (II) (25 µM) o FeS2 (2 mM) para imitar las condiciones de cultivo utilizadas en los experimentos hasta este punto. A estos, se les añadió Mo como MoO42- y la concentración de MoO42- y su conversión a MoO4-nSn2- se controlaron mediante ensayos colorimétricos78 y espectroscopía UV-Vis71, respectivamente. Los experimentos se realizaron con 10 µM de MoO42- (a diferencia de 4 µM utilizados para cultivar MmS2 en el presente documento) para aumentar la sensibilidad de la señal de modo que estuviera dentro del rango dinámico de los ensayos que se usaron.

Las concentraciones de MoO42- se mantuvieron entre ~8–10 µM en reactores no modificados con HS- en presencia o ausencia de FeS2 (Figura complementaria 4a). Como se esperaba, el producto de la tiolación completa de MoO42-, tetratiomolibdato (MoS42-), no se detectó en estas condiciones durante el transcurso del experimento (Figura complementaria 4b). Por el contrario, las concentraciones de MoO42- disminuyeron rápidamente (dentro de las primeras 12 h de incubación) cuando se agregaron HS- solo o HS- y Fe (II) a los reactores (Figura complementaria 4a). En reactores que contenían HS-, MoS42- se produjo rápidamente (dentro de la primera hora de incubación) y MoO42- se convirtió completamente en MoS42- después de 72 h de incubación. En reactores que contienen HS- y Fe (II), la conversión de MoO42- a MoS42- se aceleró y la conversión completa se produjo dentro de las primeras 3 h de incubación (Figura complementaria 4b). La espectroscopia UV-Vis reveló la producción de intermedios MoO4-nSn2- en reactores modificados con HS- con o sin Fe (II) (Figura complementaria 5). Los iones de MoO42-/tiomolibdato tienen una fuerte afinidad por el Fe, incluido el Fe en los sulfuros de hierro79,80, y se ha demostrado que estos iones reaccionan fácilmente para formar estructuras estables de tipo cubano Fe-Mo-S en ambientes ricos en azufre80. Es posible que la aceleración de la tiolación de MoO42 por el Fe (II) en los experimentos descritos aquí sea igualmente atribuible a la formación de grupos estables de tipo cubano Fe-Mo-S. Independientemente, estos datos indican que MoO42- está fácilmente disponible en cultivos cultivados con FeS2, mientras que las formas predominantes de Mo en cultivos cultivados con Fe(II)/HS- son una mezcla de MoS42- y MoO4-nSn2-. Esto podría explicar potencialmente el crecimiento deficiente y la expresión elevada de genes mod en cultivos fijadores de N2 provistos de Fe (II) / HS- en relación con FeS2. Se desconoce si las células MmS2 fijadoras de N2 en condiciones de Fe(II)/HS- utilizan niveles submicromolares de MoO42- que están por debajo del límite de detección (~1 µM) del ensayo colorimétrico utilizado en este documento o si pueden utilizar MoO4-nSn2- (aunque de forma limitada según los datos de crecimiento) para satisfacer sus demandas nutricionales de Mo.

Para probar aún más la hipótesis de que las condiciones euxínicas (es decir, exceso de HS-) limitan la disponibilidad de MoO42- en cultivos de MmS2, se comparó el crecimiento de las células fijadoras de N2 provistas de Fe(II)/HS- con el de las células fijadoras de N2 provistas de Fe(II)/HS-. FeS2 en presencia o ausencia de HS- añadido 2 mM. También se probó un cultivo de MmS2 modificado con NH3 provisto de FeS2 y HS- añadido 2 mM. Como se observó anteriormente, MmS2 cultivado con FeS2 exhibió una cinética de crecimiento y producción de CH4 más rápida y generó mayores rendimientos celulares que los cultivos provistos de Fe (II) / HS- al fijar N2 (Fig. 4a, b). En comparación, los cultivos cultivados con FeS2 con HS- añadido 2 mM, independientemente de la fuente de N, mostraron tasas significativamente más lentas de producción de células y CH4, lo que demuestra que HS- disminuye el crecimiento de MmS2 en células provistas de FeS2. Si bien los cultivos fijadores de N2 y modificados con NH3 proporcionados con FeS2 y condiciones de HS agregadas 2 mM crecieron pobremente, las células fijadoras de N2 se vieron afectadas más negativamente.

Se agregaron dos mM de HS a cultivos fijadores de nitrógeno o modificados con amoníaco provistos de pirita como fuente principal de hierro y azufre para probar su efecto sobre la producción de células (a) y metano (b). Se muestra el efecto de diferentes concentraciones de molibdato sobre las tasas de crecimiento (c) y los rendimientos (d) de células cultivadas con pirita o hierro ferroso y sulfuro como única fuente de hierro y azufre en condiciones de fijación de nitrógeno. Las tasas de crecimiento máximas (calculadas a partir de las densidades celulares medidas) se determinaron durante un período de 5 días para cada réplica. Los datos presentados son la media y la desviación estándar de tres réplicas biológicas por condición. Amoniaco NH3, dinitrógeno N2, hierro ferroso Fe(II), metano CH4, pirita FeS2, sulfuro HS-.

Si HS- impacta negativamente el crecimiento celular bajo condiciones de fijación de N2 a través de su efecto sobre MoO42-, se esperaría que las células cultivadas en FeS2 tuvieran menores requerimientos de MoO42- en solución que las células cultivadas con Fe(II)/HS- ya que relativamente Se liberan pequeñas cantidades de HS- en la solución durante la reducción del FeS2. Experimentos anteriores realizados con células MmS2 cultivadas con H2 y fijadoras de N2 provistas de Fe (II) / HS encontraron que se requería> 400 nM de MoO42 para el crecimiento con un óptimo de 4000 nM42. Estos valores son mucho más altos que los requeridos para otros organismos fijadores de N2. Por ejemplo, las cianobacterias aeróbicas fijadoras de N2 como Anabaena variabilis81, así como las bacterias anaeróbicas del azufre púrpura (PSB) fijadoras de N2 que habitan en la interfaz de aguas óxicas/euxínicas y que sirven como un análogo moderno de los márgenes continentales productivos de los océanos proterozoicos82. , puede ser soportado por menos de 10 nM MoO42-. Curiosamente, la fijación máxima de N2 para PSB fue máxima por encima de la quimioclina donde HS- estaba cerca de cero82. Por lo tanto, parece incongruente que los metanógenos requieran 40 veces más MoO42- que estos organismos, a pesar de que los ancestros de los metanógenos probablemente sean donde se originó el Nif6,9.

Para probar esto más a fondo, a las células MmS2 cultivadas con formiato y fijadoras de N2 se les proporcionó un rango de concentraciones de MoO42 con Fe (II)/HS- o FeS2 como única fuente de Fe/S. De acuerdo con trabajos anteriores, MmS2 cultivado en Fe (II) / HS mostró poca o ninguna respuesta de crecimiento en condiciones con <100 nM MoO42, pero las tasas de crecimiento aumentaron sustancialmente cuando se proporcionó ≥500 nM MoO42 (Fig. 4c). Los rendimientos celulares no alcanzaron los niveles máximos en células cultivadas con Fe (II) / HS hasta que se proporcionó MoO42 > 1000 nM (Fig. 4d). Sorprendentemente, las células provistas de FeS2 crecieron bien en todas las concentraciones de Mo analizadas, incluso cuando se agregó MoO42-0 µM (Fig. 4c). Después de este experimento, los reactores abióticos que contenían medios y FeS2 (sin MoO42 agregado) se analizaron mediante ICP-MS y se determinó que tenían Mo de fondo (contaminante) en un rango de 10 a 30 nM a pesar de usar productos químicos de grado ACS y cristalería lavada con ácido. Por lo tanto, las células fijadoras de N2 cultivadas con Fe (II) / HS requirieron> 500 nM de MoO42- para lograr tasas de crecimiento y rendimientos casi óptimos, mientras que las células fijadoras de N2 cultivadas con FeS2 requirieron <30 nM de MoO42-.

En conjunto, estos resultados sugieren que las células MmS2 cultivadas con FeS2 (en ausencia de altas concentraciones de HS- libre) pueden acceder a MoO42- en concentraciones nM que son >10 veces más bajas que las reportadas previamente para esta cepa42. Además, las células MmS2 pueden alcanzar tasas de crecimiento y rendimientos óptimos en concentraciones de MoO42 que se encuentran en niveles ~100 veces más bajos que los informados anteriormente42. A pesar de tasas de crecimiento similares para las condiciones de FeS2 en diferentes concentraciones de MoO42, hubo una tendencia positiva en el rendimiento celular con el aumento de MoO42, lo que indica que las concentraciones más altas de MoO42 todavía son beneficiosas para estas células (Fig. 4d). Estos hallazgos son consistentes con otros estudios que han demostrado la fijación de N2 a bajas concentraciones de Mo con células cultivadas en condiciones no sulfurosas81,82. En particular, los niveles bajos (10-30 nM) de MoO42- que se muestra que apoyan la fijación de N2 en este documento son similares a las concentraciones inferidas de Mo de los océanos Proterozoicos (83,84,85). Otros estudios que investigaron los requisitos de Mo para otras especies metanógenas que fijan N2 encontraron que 1 a 10 µM MoO42- eran las concentraciones óptimas86,87. Hay otro ejemplo de metanógenos que fijan N2 a concentraciones bajas (<10 nM) de MoO42-; Nishizawa et al. demostraron que los aislados de Methanocaldococcus y Methanothermococcus de un respiradero hidrotermal podían fijar N2 con concentraciones tan bajas como 5 nM o 1 µM de MoO42-, respectivamente59. Esto indica que diferentes especies de metanógenos dentro del mismo ambiente hidrotermal (a diferentes temperaturas) pueden tener requisitos de Mo muy diferentes. Es importante destacar que todos estos experimentos anteriores se realizaron en presencia de> 1 mM HS-, lo que requiere una reevaluación de la capacidad de los metanógenos y otros anaerobios para acceder a MoO42- en ausencia de HS- alto. Estos datos respaldan la hipótesis de que la fijación de N2 a través de Nif es más eficiente en condiciones de baja HS donde el Mo es más biodisponible.

El exceso de HS reprimió el crecimiento de MmS2 cuando se cultivó con FeS2 (condiciones euxínicas), independientemente de la fuente de N proporcionada (Fig. 4). A continuación, se comparó el crecimiento de las células fijadoras de N2 en cultivos cultivados con FeS2 con formulaciones de medio diseñadas para imitar condiciones levemente (100 µM de Fe (II) agregado) y altamente (1000 µM de Fe (II) agregado) condiciones ferruginosas y para imitar levemente ( 100 µM añadido HS-) y condiciones altamente euxínicas (1000 µM añadido HS-). Los cultivos de control contenían FeS2 como única fuente de Fe y S. Las densidades celulares y las concentraciones de CH4 se controlaron como indicadores de crecimiento, y se midió HS- como indicador de la reducción de FeS2.

Las células MmS2 crecieron mejor en condiciones levemente ferruginosas en comparación con condiciones leves y altamente euxínicas, aunque la condición altamente ferruginosa causó una fase de retraso más larga (Fig. 5a). El crecimiento de células MmS2 en condiciones euxínicas, especialmente con HS- añadido 1000 µM, disminuyó considerablemente en relación con las células cultivadas con FeS2 como control. A pesar de las diferencias en las densidades generales de las células al final del experimento, todas las condiciones produjeron cantidades similares de CH4 (Fig. 5b). Esto condujo a diferencias pronunciadas en los rendimientos celulares finales (Fig. 5d), así como en los rendimientos durante la fase logarítmica (Fig. 6 complementaria). En particular, los rendimientos celulares para la condición ligeramente ferruginosa fueron los más altos incluso en relación con la condición de control (solo FeS2). Nuevamente, los rendimientos de las células cultivadas en condiciones euxínicas fueron significativamente más bajos que los de las cultivadas en condiciones ferruginosas o en la condición de control (solo FeS2). En conjunto, estos datos sugieren que se prefieren condiciones ligeramente ferruginosas para las células MmS2 fijadoras de N2.

La producción de células (a), metano, CH4 (b) y HS- (c) se monitoreó en cultivos de MmS2 provistos de pirita (FeS2) 2 mM como única fuente de Fe/S, con FeS2 y 100 o 1000 µM de Fe(II), o con FeS2 y 100 o 1000 µM HS-. Los rendimientos celulares (d) en cada condición de crecimiento se calcularon utilizando las concentraciones iniciales y máximas de células y CH4 para cada réplica. La leyenda en la parte inferior de la figura se aplica a los cuatro paneles. Las diferencias estadísticamente significativas (p <0,05, prueba t) se determinaron por pares en el panel d y se representan encima de cada barra utilizando los símbolos de la leyenda para indicar los pares significativamente diferentes. Los datos presentados son la media y la desviación estándar de tres réplicas biológicas por condición. Hierro ferroso Fe(II), metano CH4, pirita FeS2, sulfuro HS-.

El sulfuro total (HS-, H2S y sulfuro de hierro lábil en ácido) se midió en muestras de cultivo no filtradas como un indicador de la reducción de FeS241. A pesar de todas las condiciones que requieren la movilización de FeS2 para acceder a Fe (condiciones euxínicas), S (condiciones ferruginosas) o Fe y S (condiciones de control), la producción de sulfuro total difirió entre las condiciones (Fig. 5c). Para FeS2 solo (condiciones de control), se observaron 34 µmol de sulfuro total al final del experimento, mientras que la condición ligeramente euxínica produjo 46 µmol de sulfuro total. Teniendo en cuenta el HS- añadido (100 µM, 7,5 µmol), se produjeron 38 µmol de sulfuro total menos lo asimilado por las células en condiciones ligeramente euxínicas. Además, esto indica que tuvo lugar una cantidad similar de reducción de FeS2 celular en estas dos condiciones de crecimiento; sin embargo, se redujo más FeS2 por célula en la condición ligeramente euxínica dada la baja producción celular. De manera similar, en la condición altamente euxínica (1000 µM, 75 µmol de HS- agregado), se midieron 148 µmol de sulfuro total al final del experimento, lo que indica que se redujo más FeS2 por célula que las condiciones de control considerando la baja producción celular en la condición anterior (Fig. 5a). La producción total de sulfuro en cultivos cultivados en condiciones ferruginosas fue mucho menor que la de los cultivos de control (solo FeS2). Específicamente, las condiciones ferruginosas levemente (Fe (II) agregado 100 µM) produjeron solo 4 µmol de sulfuro total, mientras que el sulfuro total permaneció indetectable en condiciones altamente ferruginosas (Fe (II) agregado 1000 µM) hasta el punto final en el que se detectaron 0,3 µmol. Por lo tanto, la cantidad de FeS2 que debe disolverse de manera reductiva para satisfacer las demandas biosintéticas de Fe o S es menor en condiciones ferruginosas que en condiciones euxínicas, lo que también puede ayudar a explicar un mejor crecimiento en estas condiciones.

El impacto que tuvo HS- en las células cultivadas con FeS2 probablemente sea atribuible a las complejas condiciones creadas cuando coexisten HS-, FeS2 y metales traza (es decir, Mo, Fe (II)). Las altas concentraciones de HS- disminuyen la favorabilidad termodinámica de la reducción de FeS241, lo que podría hacer que la reducción de FeS2 sea el proceso limitante de la velocidad en estos cultivos y posiblemente explique la producción más lenta de CH4 observada en cultivos cultivados con FeS2 con HS- agregado (Figs. 4b y 5b). . Además, un nivel alto de HS- puede reducir la disponibilidad de metal no solo de MoO42-, sino también de Fe(II) que se libera durante la reducción de FeS2. Spietz et al. describen un modelo para la disolución reductora de FeS2 por metanógenos en el que la reducción de FeS2 libera HS- en solución y la pirrotita (Fe1-xS) se precipita como fase secundaria en la superficie mineral41. La disolución de Fe1-xS da como resultado la liberación de Fe(II) (pero no HS-) que luego puede reaccionar con HS- soluble para formar grupos de FeS(aq), la supuesta fuente de Fe/S para estas células39,41. En experimentos abióticos con Fe1-xS secuestrado en membranas de diálisis de 100 kDa, se demostró que la disolución y/o difusión de Fe desde Fe1-xS al medio en masa disminuyó significativamente en presencia de HS- 500 µM en comparación con HS no agregado. -41. Esto puede indicar que el HS aumenta la tasa de nucleación y reprecipitación del FeS (aq) como nanopartículas de mackinawita (FeSmack) que son demasiado grandes para difundirse a través de la membrana celular. Se esperaría que tales partículas limitaran la disponibilidad de Fe (y S) para las células41. Se supone que estos efectos del HS- no ocurren en condiciones ferruginosas porque el Fe (II) elimina eficazmente el HS- o porque las células minimizan la reducción de FeS2 de modo que todo el HS- liberado en el proceso se asimila. También es importante considerar la tendencia de los metales traza a ser adsorbidos en las superficies de FeS2, lo que, a su vez, reduce su concentración en solución. Este es el caso del MoS42-, el producto de la tiolación completa del MoO42- (ver arriba), que se adsorbe más fuertemente en las superficies de FeS2 que el MoO42-80.

Los experimentos realizados aquí tuvieron como objetivo identificar las condiciones más plausibles (euxínicas o ferruginosas) que habrían permitido la fijación de N2 a través de Nif durante el Proterozoico temprano, cuando los datos filogenéticos indican que esta enzima evolucionó6,7,8, o incluso a finales del Arcaico, cuando la enzima isotópica evolucionó. los datos sugieren que esta enzima o su predecesora evolucionaron21,22. Se realizaron experimentos con el metanógeno marino, MmS2, que alberga un homólogo de Nif que pertenece al linaje Nif de ramificación más profunda6,8,9. Los datos mostraron que las condiciones euxínicas (exceso de HS- en relación con Fe (II) libre) afectaron negativamente el crecimiento de las células MmS2 fijadoras de N2, independientemente de si se cultivaron con Fe (II)/HS- o FeS2. Se demostró que esto se debe al efecto del HS- sobre la especiación y disponibilidad de Mo. Sin embargo, en condiciones ferruginosas, el exceso de Fe(II) valora el HS-, lo que lleva a su precipitación como FeSmack y FeS2, lo que, a su vez, permite que el Mo se permanecen biodisponibles como MoO42-. De hecho, la tasa de crecimiento y el rendimiento de las células MmS2 fijadoras de N2 fueron significativamente mayores cuando las células se cultivaron con FeS2 y exceso de Fe (II) (condiciones ferruginosas) que cuando se cultivaron con i) FeS2 y exceso de HS- (condiciones euxínicas), ii) FeS2 solo, o iii) en condiciones canónicas típicamente utilizadas para cultivar metanógenos, exceso de HS- y Fe (II) (también una condición euxínica).

En conjunto, estos datos indican que MmS2 prefiere FeS2 sobre Fe (II) / HS- durante el crecimiento con formiato como sustrato de metanogénesis y con N2 como única fuente de N, condiciones que aumentan la demanda de Mo a través de Fdh, Nif y Fmd. Además, las células crecieron más eficientemente con FeS2 cuando MoO42- tenía una concentración ~100 veces menor que las células cultivadas con Fe(II)/HS-. Estos datos sugieren que un ambiente ferruginoso habría favorecido la función y potencialmente el origen de Nif en la Tierra primitiva. Por el contrario, las condiciones euxínicas plantean desafíos importantes para acceder a los metales tiofílicos necesarios para las células fijadoras de N2 en entornos tanto antiguos como modernos, lo que limita la fijación de N2 a través de Nif. Dado que la disponibilidad de metales es un factor importante en la evolución de las metaloenzimas (revisado en 83), sugerimos que Nif probablemente evolucionó en un entorno que favorecía la disponibilidad de Fe y Mo.

El FeS2 sintético se sintetizó en una cámara anaeróbica mezclando soluciones separadas de 16,7 g de FeSO4 · 7 H2O y 17,28 g de Na2S · 9 H2O, cada una disuelta en 50 ml de MilliQ H2O (MQ) anóxico y desionizado en una botella de medio de 500 ml. Luego se añadieron 2,1 g de azufre elemental al reactor, que luego se selló con un tapón de goma y se retiró de la cámara anaeróbica. Luego el reactor se incubó durante cuatro días a 65 °C seguido de otros cuatro días a 85 °C. Luego se enfrió el reactor a temperatura ambiente y se abrió en una campana de extracción química donde el mineral resultante se recogió en tubos de centrífuga y se lavó varias veces aeróbicamente con MQ, HCl 1 M, HCl 6 M y acetona. Finalmente, el mineral se lavó en MQ anóxico y estéril varias veces dentro de una cámara anaeróbica y se transfirió a una botella de suero de vidrio estéril en forma de suspensión40. La muestra seca de FeS2 se trituró y tamizó (tamaño de partícula de 63 a 150 µm) antes de someterla a la misma serie de lavados que el FeS2 sintético. Luego, la muestra de FeS2 se secó bajo una corriente de N2 y se almacenó en una botella de suero de vidrio estéril hasta que se pesó en una cámara anaeróbica y luego se añadió directamente a las botellas de cultivo. Se añadió FeS2 sintético a las botellas de cultivo preparadas en forma de suspensión. Los minerales se caracterizaron por difracción de rayos X antes de su uso en experimentos (Figura complementaria 7).

La cepa S2 (MmS2) de M. maripaludis, amablemente proporcionada por el Dr. Kyle Costa, se cultivó en un medio basal libre de Fe y S que contenía (g L-1): NaCl, 21,98; MgCl2 · 6H2O, 5,10; NaHCO3, 5,00; K2HPO4, 0,14; KCl, 0,33; CaCl2 · 2H2O, 0,10. Para los cultivos modificados con NH3, se añadió NH4Cl hasta una concentración final de 0,50 g L-1. El medio basal se modificó con FeCl2 · 4H2O 25 µM y Na2S · 9H2O 2 mM para células cultivadas con Fe(II)/HS. Los experimentos de adición de sulfuro probaron el efecto de HS-2 mM durante el crecimiento en FeS2. Se agregaron hierro y HS- a partir de soluciones madre anóxicas esterilizadas en autoclave durante 30 min. antes de la inoculación. Para las condiciones de crecimiento de FeS2, el medio basal se modificó con FeS2 sintético hasta una concentración final de Fe 2 mM (0,018 g por 75 ml de medio) o con 1,5 g de muestra de FeS2. Se añadió la mayor cantidad de FeS2 de la muestra para tener en cuenta las diferencias en el área de superficie estimada de la muestra frente al FeS240 sintético. El medio basal se modificó (cada concentración final al 1% v/v) con soluciones de oligoelementos, vitaminas, formiatos y acetatos (Tabla complementaria 4). Las soluciones de vitaminas se esterilizaron por filtración (0,22 µm), mientras que las soluciones de oligoelementos, formiato y acetato se esterilizaron individualmente en autoclave. Todas las soluciones se rociaron con N2 filtrado (0,22 µm). El N2 y otros gases utilizados en este estudio se hicieron pasar a través de una columna calentada (300 °C) que contenía virutas de cobre reducidas en H2.

Para preparar el medio de crecimiento, todos los componentes, excepto NaHCO3, se disolvieron en MQ H2O y luego se hirvieron durante menos de 1 min. Después de hervir, la botella que contenía el medio se retiró del fuego y se selló con un tapón de caucho butílico con una cánula de metal y una aguja de ventilación y se roció con gas N2 durante 1 h por litro de medio. Después de la desgasificación, se selló la botella, se llevó a una cámara anaeróbica y se añadió NaHCO3 después de enfriar. Después de agregar estos componentes, el pH del medio se ajustó a 7,00 usando HCl 2 M anóxico o NaOH 1 M. Se dispensaron setenta y cinco mililitros de medio en botellas de suero de 165 ml que luego se sellaron con tapones de caucho butílico azul de 20 mm (Bellco, Vineland, Nueva Jersey) nuevos y recién hervidos y tapas de aluminio. El espacio de cabeza de las botellas medianas se purgó con 80:20 N2:CO2 durante 20 min. Luego los frascos se esterilizaron en autoclave durante 20 min a 123 °C. Después del autoclave, se agregaron FeS2, Fe (II), HS-, oligoelementos, vitaminas y compuestos orgánicos a las concentraciones indicadas anteriormente.

MmS2 se mantuvo mediante transferencias dos veces por semana en un medio definido con Fe(II)/HS-, N2 gaseoso y formiato. Los cultivos se inocularon en una proporción del 5% v/v con células cultivadas en condiciones de fijación de N2 y a las que se les proporcionó Fe(II)/HS-. Todas las células se lavaron en medio basal libre de NH3 (sin adiciones) mediante centrifugación a 4696 x g durante 20 minutos a 20 °C en un rotor de cubo oscilante para todos los experimentos. Luego se contó inmediatamente la densidad de una alícuota de las células lavadas antes de usarlas como inóculo. Los cultivos se presurizaron a 2,87 atm con 80:20 N2:CO2 o Ar:CO2. Todos los cultivos se incubaron estáticamente de lado a 38 °C en la oscuridad.

Se tomaron muestras del gas del espacio de cabeza de los microcosmos con una jeringa y una llave de paso llenas de N2 y se diluyó con N2 de pureza ultra alta en bolsas CaliBond (Calibated Instruments Inc., Manhasset, NY) antes de la determinación de CH4. Se tomaron muestras líquidas en la mesa de trabajo utilizando una jeringa y una aguja bañadas con N2. El CH4 se cuantificó mediante cromatografía de gases y el sulfuro total se cuantificó colorimétricamente mediante el ensayo de azul de metileno, como se describió anteriormente40. Las células para el recuento directo se fijaron primero durante cuatro horas en glutaraldehído al 2,5% v/v (concentración final) a 4 °C y luego se contaron utilizando una cámara de recuento Petroff-Hausser en un microscopio óptico Nikon YS100 con un objetivo de aceite de 100x (Nikon , Tokio, Japón). Las muestras de células fijadas se concentraron mediante centrifugación a 15.000 x g durante 15 min y se resuspendieron en el medio basal de un volumen suficiente para facilitar el recuento celular.

Para probar la estabilidad de MoO42- en varias formulaciones de medio utilizadas en este documento, se agregaron 75 ml de medio de sales base libre de NH3 que contenía oligoelementos sin MoO42-, formiato, acetato o vitaminas a botellas de suero de 165 ml. La preparación del medio fue como se describió anteriormente para cultivos de MmS2. La composición del espacio de cabeza fue 80:20 N2:CO2. El medio se modificó con Na2MoO4 · 4H2O (concentración final de 10 µM), Na2S · 9H2O (2 mM), FeCl2 · 4H2O (25 µM) o FeS2 sintético (2 mM). Los reactores se incubaron a 38 °C en la oscuridad y se transfirieron a una cámara anaeróbica (97,5 % N2, 2,5 % H2) y se recogieron submuestras para espectroscopia mediante una jeringa y una aguja y se colocaron en cubetas de plástico desechables (1 cm de longitud de trayectoria) que se sellados con tapas de plástico para cubetas antes de retirarlos de la cámara anaeróbica. La concentración de MoO42- se determinó colorimétricamente utilizando un ensayo de catecol modificado78. El ensayo se modificó para aumentar cuatro veces las concentraciones de los componentes de la solución de trabajo y la relación de volumen de muestra a solución de trabajo se ajustó a 4:1, con un volumen total de ensayo de 1 ml que se midió a 400 nm con un Genesys 10 S. Espectrofotómetro Vis (Thermo Scientific, Waltham, MA). La solución de trabajo se preparó y almacenó en la cámara anaeróbica 2 semanas antes del experimento. Para la cuantificación del tetratiomolibdato, se midió directamente 1 ml de la muestra a 467 nm. Se realizaron exploraciones UV-Vis (300 nm a 525 nm) en un espectrofotómetro Cary UV-Vis-NIR 6000i (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) utilizando las mismas muestras preparadas para la cuantificación de tetratiomolibdato. Los valores de absorbancia de las muestras para cada ensayo se compararon con una curva estándar que se preparó con reactivos nuevos (Na2MoO4 · 4H2O o MoS4(NH4)2).

Para caracterizar el tamaño de las células cultivadas en diferentes condiciones, se realizó microscopía electrónica de emisión de campo (MEF). Se tomaron cinco mililitros de cultivo celular como submuestra de cultivos de fase logarítmica media utilizados en experimentos de transcriptómica (ver más abajo). Las células se fijaron durante dos horas a temperatura ambiente en glutaraldehído de grado EM al 2,5% (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) en medio basal. Luego, las células fijadas se filtraron sobre un filtro de policarbonato Isopore negro de 0,2 µm previamente pulverizado con Au (MilliporeSigma, Burlington, MA) utilizando una filtración suave al vacío. Luego se lavaron las células añadiendo 10 ml de medio basal al filtro. Después del lavado, las células se sometieron a una serie de deshidratación con etanol (mediante filtración) usando etanol de grado molecular (25%, 50%, 70%, 85%, 95%, 100%) y luego se almacenaron a 4 °C hasta que se realizó FEM. realizado en el Laboratorio de Análisis Químico e Imágenes de la Universidad Estatal de Montana. Las muestras se montaron en el soporte FEM utilizando cinta de carbono de doble cara y se pulverizaron con una fina película de iridio para obtener conductividad antes de obtener imágenes. El MEF se realizó utilizando un microscopio electrónico Supra 55VP de alta resolución (Zeiss, Thornwood, NY) con una energía de haz de electrones primario de 1 keV a diferentes aumentos. El tamaño de las celdas se determinó usando ImageJ para medir manualmente las celdas individuales registrando la longitud de dos mediciones normales calibradas en la barra de escala de la imagen.

La transcriptómica de escopeta se realizó en células de MmS2 cultivadas en condiciones de fijación de N2 o de modificación de NH3 con Fe (II)/HS- o FeS2 como única fuente de Fe/S. Se recolectaron cincuenta mililitros de cultivo durante la fase media de registro en una cámara anaeróbica mediante centrifugación a 4696 x g durante 30 minutos a 4 °C. Luego se descartó el sobrenadante y los tubos se retiraron de la cámara anaeróbica y se congelaron inmediatamente en N2 líquido. Los sedimentos celulares se almacenaron a -80 ° C hasta la extracción del ARN.

El ARN total se extrajo de los sedimentos celulares utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo el protocolo del fabricante con modificaciones menores. Se añadió un mililitro de TRIzol a los sedimentos celulares y las células resuspendidas se transfirieron a tubos Lysis E (MP Biomedicals, Irvine, CA) en hielo. Las muestras de células se lisaron mecánicamente mediante tres ciclos de 40 segundos de batido de perlas y 5 minutos de reposo a temperatura ambiente (~20 °C). Luego del procedimiento de lisis, se agregaron 200 µL de cloroformo grado molecular, los tubos se mezclaron por inversión y se dejaron incubar durante 3 min a temperatura ambiente. Luego, los tubos se centrifugaron durante 15 minutos a 12.000 xg a 4 °C y la fase acuosa superior que contenía ARN se transfirió con una pipeta a un tubo limpio de 2 ml. El ARN se precipitó mediante la adición de 0,5 ml de isopropanol 100% de grado molecular que se había enfriado previamente a 4 °C seguido de una incubación de 10 minutos en hielo. Luego se sedimentó el ARN mediante centrifugación durante 10 minutos a 12.000 x g a 4 °C. El sobrenadante se eliminó con una pipeta y el ARN se lavó en 1 ml de etanol de grado molecular al 75 %. El ARN se sedimentó mediante centrifugación durante 5 minutos a 7500 xg a 4 °C, se eliminó el sobrenadante y el sedimento de ARN se secó al aire durante 10 minutos. Una vez seco, el ARN se resuspendió en 50 µL de H2O libre de ARN (Fisher Scientific, Waltham, MA) incubando a 55 °C en un bloque térmico durante 10 minutos. Se trató el ARN para eliminar el ADN residual mediante la adición de Turbo DNase (Invitrogen, Waltham, MA) según las instrucciones del fabricante. Luego, el ARN se sometió a una segunda ronda de pasos de precipitación, lavado, secado y resuspensión como se describió anteriormente. El ARN se cuantificó utilizando un fluorómetro Qubit 2.0 con un kit de ARN Qubit BR (Invitrogen) y la calidad se analizó utilizando un espectrómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific). La contaminación del ADN se comprobó realizando una amplificación por PCR utilizando cebadores de ARNr 16S específicos de arqueas y asegurándose de que no se hubiera producido ninguna amplificación mediante electroforesis en gel. Luego, el ARN se envió al Centro de Expresión del Genoma de la Universidad de Wisconsin para control de calidad, agotamiento del ARNr utilizando oligonucleótidos personalizados específicos de Methanococcus (Tabla complementaria 5) y secuenciación en un Illumina NovaSeq 2 × 150 pb (Illumina, San Diego, CA).

¡Las lecturas de extremos pares de ARN se procesaron utilizando la configuración predeterminada en TrimGalore! (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/), un contenedor que implementa CutAdapt88 para eliminar secuencias de adaptadores y FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc /) para filtrar lecturas. Las lecturas se alinearon con el genoma MmS2 de referencia (ASM1158v1) utilizando BowTie289. Los perfiles transcripcionales se generaron mediante recuento de lecturas para cada locus utilizando HTSeq90, luego se normalizaron y analizaron en DESeq291 implementado en R v3.6.0. Los datos de secuenciación de ARN informados en este artículo se depositaron en la base de datos NCBI GEO (GSE216895).

Se cultivaron cultivos duplicados de MmS2 (ver arriba) y se combinaron para proporcionar una masa de muestra suficiente para análisis de isótopos de biomasa celular y CH4. Los cultivos se cultivaron con Fe(II)/HS- o FeS2 en condiciones de fijación de N2 o modificadas con NH3 y se cosecharon durante la fase tardía de crecimiento. Se determinaron las concentraciones de CH4 de cada duplicado y las densidades celulares se determinaron después de combinar los duplicados. Los cultivos se recolectaron en una cámara anaeróbica después de alcanzar> ~ 3 × 107 células por ml mediante centrifugación en tubos de centrífuga de 50 ml (Globe Scientific, Mahwah, Nueva Jersey) durante 30 minutos a 4696 x g a 4 ° C. El sobrenadante se eliminó usando una línea y una aguja a bajo vacío y las células se resuspendieron en 8 ml de medio basal y se transfirieron a un tubo de centrífuga de 15 ml (Globe Scientific).

Para eliminar el FeS2 a granel (si estaba presente), la muestra se cubrió con una solución de trabajo Percoll (GE Healthcare, Chicago, IL) con NaCl 0,4 M según las instrucciones del fabricante utilizando una jeringa y una cánula. Luego, las muestras se centrifugaron a 2000 x g en un rotor de cubeta oscilante durante 20 minutos a 4 °C. La fase acuosa superpuesta que contenía células se eliminó con una pipeta y se transfirió a un tubo de centrífuga limpio de 50 ml, al que se agregaron ~40 ml de medio basal nuevo y los tubos se mezclaron con un vórtex. Luego, los tubos se centrifugaron durante 30 minutos a 4696 xg a 4 °C para sedimentar las células lejos de cualquier Percoll residual. Luego se eliminó el sobrenadante mediante vacío y los sedimentos celulares se resuspendieron en 1,5 ml de medio basal y se transfirieron a tubos de microcentrífuga con tapa de rosca de 2,0 ml (Thermo Scientific). Se tomó una submuestra (10 µl) de células y se diluyó para la enumeración celular después del procesamiento. La biomasa se concentró mediante centrifugación durante 20 min a 15.000 xg a 4 °C en un rotor de ángulo fijo y el sobrenadante se eliminó con una pipeta.

Los sedimentos celulares se congelaron a -80 ° C hasta su envío a Geociencias de la Universidad Estatal de Utah para análisis de isótopos estables de C y N. Los sedimentos celulares se secaron aeróbicamente incubándolos durante 16 h a 60 °C en una estufa de secado. Una vez seca, la biomasa se sacó de los tubos, se pesó y se preparó adicionalmente para el análisis moliéndola hasta obtener un polvo y transfiriéndola a cápsulas de estaño. Luego se realizó el análisis de isótopos de los valores de δ15N (frente a AIR) y δ13C (frente a VPDB) mediante combustión y cromatografía de gases de las muestras de biomasa a 1000 °C utilizando un analizador elemental Costech 4010 acoplado con una masa de relación de isótopos Thermo Scientific Delta V Advantage. espectrometría (GC-IRMS). Para el análisis de CH4 con δ13C, se enviaron muestras de gas de los cultivos utilizados en los experimentos de isótopos anteriores a la Universidad del Norte de Arizona y se analizaron en un espectrómetro de anillo de cavidad Picarro G2201-I. Un estándar comercial de CH4 δ13C −60‰ (frente a VPDB) (Airgas, Plumsteadville, PA) sirvió como estándar de calibración además del aire libre de metano “aire cero” para los análisis de Picarro.

Todos los datos mostrados son valores medios de al menos tres réplicas independientes, con barras de error que muestran la desviación estándar de las réplicas. Se utilizaron pruebas t de Student independientes para calcular los valores de p aquí informados para todos los experimentos, excepto para los experimentos de transcriptómica, para los cuales los valores de p se determinaron mediante una prueba de Wald calculada en el paquete DEseq2 implementado en R. Los resultados se consideraron significativamente diferentes cuando p < 0,05.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus materiales complementarios. Los datos numéricos y replicados utilizados para todas las figuras se proporcionan en los Datos complementarios 1. Los datos de secuenciación de experimentos de transcriptómica están disponibles a través del NCBI Gene Expression Omnibus con el ID de acceso GSE216895. Todos los demás datos están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Este trabajo fue apoyado por la División de Ciencias Químicas, Geociencias y Biociencias, Oficina de Ciencias Energéticas Básicas del Departamento de Energía de EE. UU. a través de la subvención DE-SC0020246 a RLS y ESB.

Departamento de Microbiología y Biología Celular, Universidad Estatal de Montana, Bozeman, MT, 59717, EE. UU.

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Pablo Dijkstra

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DP: contribuyó al diseño experimental, la realización de experimentos y la redacción del manuscrito. RLS: contribuyó al diseño experimental, la realización de experimentos y la redacción del manuscrito. DLN: contribuyó al diseño experimental, la realización de experimentos y la redacción del manuscrito. PD: contribuyó al diseño experimental, realización de experimentos y redacción del manuscrito. ESB: contribuyó al diseño experimental y redacción del manuscrito.

Correspondencia a Eric S. Boyd.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Masaru Nobu, Tom Jilbert y al otro revisor anónimo por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Anna Heintz-Buschart y David Favero.

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Payne, D., Spietz, RL, Newell, DL et al. Influencia del sulfuro en el crecimiento diazotrófico del metanógeno Methanococcus maripaludis y sus implicaciones para el origen de la nitrogenasa. Común Biol 6, 799 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05163-9

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Recibido: 10 de diciembre de 2022

Aceptado: 21 de julio de 2023

Publicado: 31 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05163-9

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