El umbral de anticuerpos protectores de la vacuna contra la malaria RTS, S/AS01 correlaciona la dosis de antígeno y adyuvante en un modelo de ratón

npj Vaccines volumen 8, Número de artículo: 114 (2023) Citar este artículo

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Los modelos de ratón son útiles para la selección temprana de candidatos a vacunas contra la malaria. El Instituto de Investigación del Ejército Walter Reed ha optimizado un modelo de exposición a esporozoitos transgénicos de Plasmodium berghei para comparar la eficacia de las vacunas de proteína circumsporozoíto (CSP) de Plasmodium falciparum. La vacuna RTS,S de GSK formulada en el adyuvante AS01 puede proteger contra la malaria a personas que nunca han padecido malaria. Informamos que la vacuna RTS,S/AS01 induce un alto nivel de protección estéril en nuestro modelo de ratón. La titulación descendente del antígeno a una dosis constante de AS01 reveló un potente efecto ahorrador de dosis de antígeno y la superioridad de RTS,S/AS01 sobre un antígeno CSP soluble. La inmunidad protectora mediada por RTS,S se asoció con un umbral de título de anticuerpos repetido importante. La titulación combinada del antígeno y el adyuvante mostró que la reducción del adyuvante podría mejorar el refuerzo de anticuerpos después de la tercera vacunación y reducir la concentración umbral de anticuerpos requerida para la protección. Los modelos de ratón pueden proporcionar una vía para la evaluación preclínica de estrategias para mejorar las vacunas CSP contra la malaria.

La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó 241 millones de casos de malaria que provocaron 627.000 muertes durante 20201. A pesar del éxito de los programas de control, la malaria parece estar aumentando y la disponibilidad de una vacuna eficaz puede acelerar en gran medida su eliminación2. La proteína circumsporozoito (CSP) de Plasmodium (P.) falciparum es la proteína más abundante en la etapa de esporozoito y se cree que es esencial para la integridad estructural, la motilidad y la invasión de los hepatocitos humanos3. Estructuralmente, P. falciparum CSP consta de un dominio N-terminal conservado, 38 repeticiones principales NANP, 4 repeticiones NVDP y un dominio C-terminal polimórfico. Los anticuerpos contra la CSP pueden bloquear la infección de los hepatocitos por esporozoitos formando un precipitado en la superficie de los esporozoitos4. La vacunación con CSP provoca una protección esterilizante contra la infección controlada por malaria humana (CHMI) transmitida a través de la picadura de mosquito5.

RTS,S/AS01E (Mosquirix) es una vacuna contra la malaria autorizada de primera generación. Siguiendo una recomendación de la OMS de 2021 para el uso rutinario en niños de ≥5 meses de edad que viven en áreas con transmisión de malaria de moderada a alta6, RTS,S se está implementando de manera piloto en Ghana, Kenia y Malawi. RTS,S es una partícula mixta que contiene el antígeno de la hepatitis BS fusionado a 18 copias de las repeticiones principales de NANP y el dominio C-terminal de la cepa CSP de P. falciparum 3D7, junto con el antígeno de la hepatitis BS libre7. RTS,S está formulado con el adyuvante patentado AS01E de GSK, que contiene una formulación liposomal de dos inmunoestimulantes: el agonista del receptor tipo peaje 4 (monofosforil lípido A (MPL)8 y la saponina QS-21 aislada de la corteza de Quillaja saponaria tree9 (25 μg de MPL y 25 μg de QS-21). El adyuvante AS01 media la mejora inmune a través de la acción sinérgica de MPL y QS2110. A principios de la década de 1990, el Instituto de Investigación del Ejército Walter Reed (WRAIR) colaboró con GSK y llevó a cabo CHMI homólogos. ensayos de formulaciones de RTS,S en voluntarios de EE. UU. 11. Los estudios CHMI aleatorios mostraron una eficacia en el rango del 30 al 50 % cuando se utiliza RTS,S con AS02 (un sistema adyuvante que contiene 50 μg de MPL y 50 μg de QS-21 en una solución de aceite en agua). emulsión) o AS01B (un sistema adyuvante que contiene 50 μg de MPL y 50 μg de QS-21 en una formulación liposomal) 12. Posteriormente se informó que la eficacia de RTS,S/AS01B en adultos de Kenia contra la malaria era de ~30% durante un período de 12 años. período de un mes 13. En niños mozambiqueños de 1 a 4 años, 3 dosis de RTS,S formuladas junto con AS02 mostraron una eficacia de ~30% durante 42 meses14,15. Una formulación pediátrica de RTS,S/AS01E administrada a niños de 5 a 17 meses en Kenia y Tanzania mostró una eficacia del 39 % y del 46 % a los 12 o 15 meses después de la vacunación16. En un ensayo multicéntrico de fase 3, se informó que la eficacia de RTS,S/AS01E era del 55 % contra la enfermedad clínica y del 47 % contra la enfermedad grave durante los primeros 12 meses de seguimiento después de la tercera vacunación17. Estudios fundamentales en África han informado de una eficacia del 46 % contra enfermedades clínicas y del 36 % contra enfermedades graves durante los primeros 18 meses de seguimiento después de la tercera vacunación18. En un seguimiento de 4 años en niños que recibieron 4 vacunas de RTS,S/AS01E, se informó una eficacia del 36 % contra la enfermedad clínica y del 32 % contra la enfermedad grave19. Estos ensayos clínicos indicaron que la vacunación RTS,S en su formulación y calendario actuales muestra una eficacia menor en áreas endémicas de malaria que en CHMI20.

Hay varias líneas de evidencia que sugieren que la eficacia de la vacuna RTS,S se puede mejorar aún más optimizando el régimen de vacunación. En un ensayo CHMI se demostró que retrasar y fraccionar la tercera dosis de RTS,S formulada en AS01 o AS02 (régimen DFD) aumenta la protección21,22. Los regímenes de dosis de refuerzo reducidas de RTS,S/AS01E también mostraron una eficacia prometedora cuando los participantes del ensayo se sometieron a una provocación 3 meses después de la última inmunización23. Si bien el régimen DFD mostró una mejora prometedora en la eficacia en adultos sin tratamiento previo, tuvo un rendimiento comparable al régimen estándar en poblaciones pediátricas que viven en regiones endémicas de malaria24. Esto puede deberse a la exposición de los vacunados RTS,S en el campo al parásito en el momento de la vacunación de refuerzo y durante los 20 meses de seguimiento de la eficacia. En otro estudio no relacionado, la preparación con adenovirus seguida de 2 dosis de RTS,S/AS01 mostró protección con un título de anticuerpos más bajo en comparación con el régimen estándar de RTS,S25. Aún no está claro si este efecto se debió a una mejor calidad de los anticuerpos o a una respuesta aumentada de las células T provocada por el régimen de refuerzo. Se necesitan más estudios con la formulación y el cronograma RTS,S/AS01 para determinar si la calidad de los anticuerpos y la eficacia de la vacuna se pueden mejorar en áreas endémicas.

Se han explorado varios modelos para evaluar la eficacia de las vacunas basadas en P. falciparum CSP. Si bien se encuentran disponibles ensayos in vitro para el recorrido y la motilidad de los esporozoitos26, los ensayos de inhibición de la invasión de hepatocitos son difíciles de estandarizar debido a las variaciones de calidad en las células hepáticas primarias27 y los esporozoitos derivados de mosquitos y la falta del microambiente tridimensional del hígado humano. Los ratones de tipo salvaje no son susceptibles a los esporozoitos de P. falciparum y se requieren cepas de ratones inmunodeficientes reconstituidas con células hepáticas humanas28,29. Los experimentos con modelos de ratones reconstituidos pueden ser costosos y estar restringidos a grupos pequeños. Las especies de roedores Plasmodium diseñadas para expresar un gen CSP funcional de P. falciparum30,31 pueden infectar de manera confiable cepas endogámicas comunes de ratones y ahora se usan de manera rutinaria para la detección temprana de candidatos a vacunas CSP32,33,34,35,36,37,38,39. 40. Las vacunas R21/Matrix-M5,41, FL-CSP/GLA-LSQ42, FMP013/ALFQ40 y los anticuerpos monoclonales CIS43LS y L943,44 se transfirieron a la clínica utilizando datos de exposición transgénica a P. berghei en ratones. El programa de malaria WRAIR ha estandarizado previamente un modelo de exposición a ratones transgénicos para evaluar vacunas CSP39. El modelo utiliza parásitos P. berghei donde el gen CSP endógeno se reemplaza por el CSP de longitud completa de P. falciparum38,39. Mientras WRAIR continúa evaluando formas de mejorar la eficacia de RTS,S, la evaluación de la vacuna RTS,S/AS01 clínicamente exitosa en nuestro modelo de exposición al ratón ha sido de considerable interés. Aquí, informamos estudios de inmunogenicidad y eficacia de RTS,S/AS01 en el modelo de exposición al ratón WRAIR. La dosis de antígeno y la formulación de la vacuna se titularon para determinar la dosis protectora del 50% (PD50). Nuestros hallazgos muestran asociaciones entre la dosis de antígeno, la dosis de adyuvante, la concentración de anticuerpos y la protección en el modelo de ratón.

Se inmunizaron ratones C57Bl/6 (n = 10) con una valoración triple del antígeno RTS,S (5 µg, 1,6 µg o 0,5 µg) en 50 µl de adyuvante AS01 o 0,75 µg de un agente soluble casi completo. CSP (FL-CSP) formulado en 50 µL de AS0140. La dosis de FL-CSP contenía una cantidad molar equivalente de CSP que el grupo RTS,S de 5 µg. AS01 utilizado en este estudio contenía 100 µg/ml de MPL y 100 µg/ml de QS-21 en una formulación basada en liposomas; por lo tanto, cada dosis de vacuna contenía 5 μg de MPL y 5 μg de QS-21. Los ratones que lograron protección estéril frente a la exposición inicial a las 2 semanas después de la tercera vacuna se volvieron a exponer a las 11 semanas después de la tercera vacuna. Los títulos aumentaron después de la segunda y tercera vacunación, pero disminuyeron aproximadamente un 50% en las 9 semanas posteriores a la tercera vacunación (Fig. 1a). 2 semanas después de la tercera vacuna, se observó una protección ≥90% en todos los grupos RTS,S (Fig. 1b). Los títulos de anticuerpos FL-CSP y de repetición principal (NANPx6) a las 2 semanas después de la tercera vacuna no difirieron significativamente entre 5 y 0,5 μg de RTS,S, aunque los títulos de C-terminal (Pf16) fueron significativamente más bajos a 0,5 μg. (Figura 1c). Los títulos de anticuerpos provocados por la vacuna FL-CSP/AS01 fueron inferiores a los del grupo RTS,S de 5 µg y dieron como resultado sólo una protección del 30 % (grupos RTS,S frente a FL-CSP, prueba exacta de Fisher, valor de P < 0,01). La nueva exposición mostró una caída en los niveles de protección, por ejemplo, 50% de protección con 0,5 μg y 80% con una dosis de 5 μg de RTS,S. Este estudio piloto demostró que cuando la dosis de AS01 se mantenía constante, se obtenían títulos anti-CSP saturados y un alto nivel de protección entre 5 y 0,5 µg de dosis de RTS,S. También se estableció la superioridad de RTS,S/AS01 sobre una dosis equivalente de FL-CSP/AS01 soluble.

a Se administraron tres vacunaciones de RTS,S o FL-CSP (flechas rojas) a intervalos de 3 semanas y se recolectaron sangrados el día 21 (3 semanas después de la primera vacuna), el día 42 (3 semanas después de la segunda vacuna) y día 52 (2 semanas después de la tercera vacuna) (líneas de puntos negros). La exposición al parásito (líneas de puntos rojas) se realizó el día 52 (2 semanas después de la tercera vacuna), y los ratones supervivientes se volvieron a exponer el día 115 (11 semanas después de la tercera vacuna). Se representan los títulos medios geométricos (GMT) frente a FL-CSP. b Curvas de supervivencia durante 2 semanas después de la tercera exposición a la vacuna (días 0 a 14 después de la exposición) y 11 semanas después de la tercera exposición a la vacuna (días 67 a 78). Todos los controles sin tratamiento previo para la nueva exposición se infectaron el día 5 (no representado). c Registre los títulos 2 semanas después de la tercera vacuna para ratones individuales contra FL-CSP (izquierda), NANPx6 (centro) y péptido Pf16 (derecha). Los ratones protegidos se muestran en rojo y los no protegidos en negro. Las barras de error representan la media geométrica ± IC del 95 % y valores significativos de ANOVA P corregidos para comparaciones múltiples (*<0,05; ***<0,001; ****<0,0001).

Para examinar el efecto de la titulación del antígeno RTS,S, se realizaron dos experimentos de exposición idénticos e independientes, AT1 y AT2, y se determinó la dosis de antígeno protector del 50 % (PD50). Los ratones C57Bl/6 (n = 10 por grupo en cada estudio) recibieron diluciones triples de antígeno RTS,S (1,5 µg a 0,01 µg) en un volumen constante de 50 µl de AS01 (Tabla 1, Fig. 2a-c). Tanto para AT1 como para AT2, una exposición a esporozoitos dos semanas después de la tercera vacunación mostró un retraso de 1 a 2 días en la permeabilidad o protección estéril en la mayoría de los grupos RTS,S. La combinación de los resultados de protección de AT1 y AT2 (n = 20 por grupo) mostró que 3 vacunaciones con 1,5 a 0,05 µg de RTS,S en 50 µL de AS01 provocaron una protección significativa en comparación con el grupo de control sin tratamiento previo (prueba exacta de Fisher, valores de P < 0,004). Un modelo logístico estimó que la dosis protectora del 50 % del antígeno RTS,S era 0,058 µg en 50 µl de AS01 para los dos experimentos de titulación de antígeno (AT) (SE = 0,016; IC del 95 % = 0,026–0,09) (Fig. 2g ). La nueva exposición de los ratones supervivientes mostró una caída en la eficacia en todos los grupos, pero la protección siguió siendo estadísticamente significativa en comparación con los controles sin tratamiento previo (prueba exacta de Fisher, valores de P <0,04). Junto con el estudio piloto, los experimentos AT1 y AT2 indicaron que dosis muy bajas de antígeno RTS,S en 50 µL de AS01 pueden conferir protección estéril en el modelo de roedor.

Curvas de supervivencia 2 semanas después de la tercera exposición a la vacuna y 11 semanas después de la tercera exposición a la vacuna para los experimentos (a) AT1, (b) AT2, (d) VT1 y (e) VT2. Todos los controles sin tratamiento previo para la nueva exposición se infectaron el día 5 (no representado). c, f Porcentaje medio de protección estéril durante 2 semanas después de la tercera vacuna y 11 semanas después de la tercera exposición a la vacuna (2wP3, 11wP3) para experimentos AT y VT, respectivamente (n = 20 por grupo). La línea negra punteada indica una protección del 50%. g Estimación de PD50 utilizando un modelo logístico de dos parámetros. Se muestran las curvas dosis-respuesta ajustadas para AT y VT.

En dos experimentos de provocación idénticos e independientes, denominados VT1 y VT2, la vacuna (antígeno + adyuvante) se tituló en incrementos de 3 veces. Las dosis de antígeno en la titulación de la vacuna (VT) variaron desde 5 µg RTS,S + 50 µL AS01 hasta 0,06 µg RTS,S + 0,61 µL AS01 y abarcaron dosis de antígeno similares probadas en AT con volúmenes de adyuvante más bajos (Tabla 1). La provocación mostró un retraso de 1 a 2 días en la permeabilidad o la protección estéril en los grupos VT1 y VT2 (Fig. 2d, e). Mientras que la protección en el estudio AT se saturó por encima de 0,5 µg en una dosis de adyuvante de 50 µL (Fig. 2c), las curvas de protección VT revelaron un efecto de dosis con una reducción gradual de la protección entre 5 y 0,55 µg (Fig. 2f). La protección estéril para los grupos VT fue significativa en comparación con los controles sin tratamiento previo (prueba exacta de Fisher, valores de P <0,04). Además, la protección estéril con 5 µg de RTS,S + 50 µL de AS01 fue significativamente mejor que 0,55 µg + 5,5 µL (valor P de la prueba de Fisher = 0,02), 0,18 µg +1,85 µL (valor P = 0,003) y 0,06 µg + 0,61 µL. grupos (valor de p = 0,0001). Asimismo, la protección estéril con 1,6 µg de RTS,S + 16,6 µL de AS01 fue significativamente mejor que con el grupo de 0,06 µg + 0,61 µL (prueba exacta de Fisher, valor de P < 0,03). La nueva exposición de los ratones supervivientes provocó infección en algunos ratones del grupo RTS,S, pero los niveles generales de protección siguieron siendo significativos en comparación con el grupo de control (valores de P de la prueba de Fisher <0,04). La estimación de la dosis protectora del 50% para los dos experimentos de VT fue de 0,186 µg de antígeno RTS,S en ~1,85 µl de AS01 (SE = 0,065; IC del 95% = 0,058–0,315) (Fig. 2g). En general, los resultados de protección del estudio VT se titularon mejor con la dosis de antígeno, requiriendo un antígeno 3,2 veces mayor para lograr una protección del 50%, en comparación con AT.

Para determinar el efecto de diferentes valoraciones en la preparación y el refuerzo de las respuestas de anticuerpos, se analizaron longitudinalmente los patrones de adquisición de anticuerpos para determinar la seroconversión después de la primera vacunación (Fig. 3) y el cambio en el título después de la segunda y tercera vacunaciones (Fig. 4). . Se requirió una dosis de antígeno aproximadamente 10 veces menor para seroconvertir ≥80 % de los ratones después de la primera vacunación (título ELISA > 100) en AT1, en comparación con VT1 (Fig. 3), lo que indica un efecto ahorrador de dosis de antígeno de dosis más altas de AS01. en AT1 después de la vacunación de cebado. Para las dosis de refuerzo, el cambio de los títulos de NANPx6, Pf16 y Hep-B después de la segunda vacunación (Fig. 4a) fue mayor en magnitud que después de la tercera vacunación (Fig. 4b). El efecto ahorrador de dosis de AS01 más alto en AT1 en los títulos de ELISA fue más obvio después de la segunda vacunación y con la dosis de antígeno más baja (AT 0,05 µg RTS,S + 50 µL AS01 vs. VT 0,06 µg RTS,S + 0,61 µL AS01, Valores de P de la prueba de Mann-Whitney <0,01) (Fig. 4a). Sin embargo, este efecto de ahorro de dosis estuvo en gran medida ausente después de la tercera dosis, a pesar de las dosis más altas de AS01 en AT (Fig. 4b). Los títulos de ELISA NANPx6, que históricamente se han correlacionado con la protección mediada por RTS,S45, mostraron un mayor refuerzo después de la tercera vacunación para los grupos VT1 que AT1 (Fig. 4b), contrariamente a las tendencias de aumento de NANPx6 observadas después de la segunda vacunación (Fig. 4a). El título medio geométrico (GMT) contra NANPx6 en AT1 se consideró saturado (DO = 1 títulos ~ 105) en todas las dosis de antígeno después de la segunda vacunación (Fig. 4c), ya que no se observó un refuerzo significativo al comparar después de la segunda y tercera vacunación. títulos de vacunación (valores de P de la prueba de Mann-Whitney no significativos). Por el contrario, el NANPx6 GMT en VT1 mostró un aumento significativo entre la segunda y la tercera vacunación (prueba de Mann-Whitney, valores de P <0,01), y se observó claramente un efecto de la titulación de la dosis de antígeno en los títulos (Fig. 4d). En conjunto, dosis más altas de adyuvante en los regímenes AT1 mejoraron el refuerzo principal de anticuerpos repetidos después de la segunda vacunación, pero pueden haber enmascarado un efecto crítico de la dosis de antígeno e inhibido el refuerzo principal de títulos repetidos después de la tercera vacunación.

El título medio geométrico (GMT ± 95 % IC) para NANPx6, Pf16 y HepB ELISA se representaron 3 semanas después de la primera vacuna para (a) AT1 y (b) VT1. La línea roja discontinua indica la DO = 1 título requerido para la seroconversión. La dosis más baja de RTS,S que logró ≥80% de seroconversión en los grupos AT1 y VT1 después de la primera vacunación se anotó en rojo.

Doble el aumento de GMT en los títulos de anticuerpos para los experimentos AT1 y VT1 observados después de (a) la segunda vacunación (proporción de título de vacuna posterior a la segunda/posterior a la primera) o (b) la tercera vacunación (proporción de título de vacuna posterior a la tercera/posterior a la segunda) ). Magnitud de los títulos de anticuerpos 3 semanas después de la segunda y 2 semanas después de la tercera vacuna para (c) AT1 y (d) VT1 contra los antígenos NANPx6, Pf16 y HepB. Las líneas punteadas representan la OD415 saturada = 1 título de 105. Se indican valores de P significativos para las pruebas U de Mann-Whitey. * P < 0,05; ** <0,01; ***<0,001; ****<0,0001). Las barras de error representan la media geométrica y el IC del 95 %.

Analizamos el efecto de los regímenes AT y VT sobre los títulos de ELISA y los resultados de la prueba 2 semanas después de la tercera vacunación (Fig. 5a, b; rojo = protegido y negro = no protegido). En AT (n = 20 por grupo), un cambio de más de 10 veces en la dosis de antígeno (1,5 a 0,15 µg) en 50 µL de AS01 no produjo una caída significativa en el título y sí una pequeña caída en la protección (85 a 70%, Tabla 1 ). En VT, un rango de dosis de antígeno similar (1,6–0,18 µg) en volúmenes inferiores de AS01 de 1,85 a 16,6 µL mostró una caída lineal (R2 = 0,98) y estadísticamente significativa en el título acompañada de una caída en la protección del 75% al 50% (Tabla 1). ). Por lo tanto, el adyuvante superior utilizado en los regímenes AT saturó la inmunogenicidad de RTS,S en dosis de antígeno más altas en el modelo de ratón. Con una dosis de antígeno relativamente alta (1,5 µg y 1,6 µg), un adyuvante 3 veces mayor en AT (50 µl frente a 16,6 µl de AS01) dio como resultado títulos similares; pero con una dosis de antígeno más baja (0,05 µg frente a 0,06 µg), un adyuvante 80 veces mayor en el régimen de AT (50 µL frente a 0,61 µL de AS01) dio como resultado un título de 10 a 30 veces mayor que favorecía a AT (Figura 1 complementaria). ). Por lo tanto, el efecto ahorrador de dosis de antígeno de AS01 sobre la inmunogenicidad de RTS,S fue más significativo cuando la dosis de antígeno era limitante.

Log GMT 2 semanas después de los títulos de la tercera vacuna representados para experimentos (a) AT y (b) VT contra antígenos de placa FL-CSP, NANPx6 y Pf16. Los ratones protegidos se muestran en rojo y los no protegidos en negro. Valores significativos de ANOVA P corregidos para comparaciones múltiples *P < 0,05; **<0,01; ***<0,001; ****<0,0001).

Para investigar más a fondo la relación entre los títulos de anticuerpos y la protección, se trazó una curva característica del operador receptor (ROC) utilizando los títulos de 2 semanas después de la tercera vacuna para AT1, AT2, VT1 y VT2 (n = 280) (Figura 2 complementaria; Tabla 2). El área bajo una curva ROC (AUC) igual a 0,5 sugiere una clasificación aleatoria, mientras que AUC = 1,0 indica una precisión de prueba perfecta46. Los valores de AUC para el título de NANPx6 (0,91) y el título de FL-CSP (0,90) fueron indicativos de una clasificación de protección excelente y no aleatoria. Por el contrario, Pf16 (AUC = 0,86) fue solo un poco menos predictivo de protección (valores de AUC de NANPx6 frente a Pf16, prueba de Chi-cuadrado, valor de P = 0,007). Los límites de título óptimos predichos por el análisis ROC en experimentos combinados de AT y VT mostraron que el título de NANPx6 (límite = 49 400) y el título de FL-CSP (límite = 123 100) clasificaron correctamente el 85 % de los resultados protegidos y el 84 % de los no protegidos (Fig. .6a). El análisis ROC también reveló que los límites de títulos protectores de FL-CSP, NANPx,6 y Pf16 para AT fueron más altos que los experimentos de VT (Tabla 2).

a Los títulos de NANPx6 frente a FL-CSP para estudios combinados de AT y VT (n = 280) y los límites de títulos de protección óptimos predichos por el análisis de AUC se muestran como líneas de puntos. El porcentaje de ratones protegidos (rojos) o no protegidos (negros) se muestra en los cuadrantes de títulos altos y bajos. b Media geométrica (±95 % CI) de concentración de anticuerpo anti-NANPx6 (μg/ml) determinada por BLI para ratones de experimento AT y VT protegidos y no protegidos; ****Valor ANOVA P < 0,0001. c, d Modelado de la eficacia protectora de los anticuerpos utilizando la ecuación de Hill para concentraciones de µg/ml o (e, f) título de ELISA NANPx6 después de la exposición. El histograma muestra la distribución de las concentraciones de anticuerpos. Las regiones sombreadas representan el IC del 95 % para la eficacia estimada de la vacuna. Las cantidades de anticuerpos previstas para una eficacia del 50 % se muestran en azul.

Dada la diferencia en los límites de ROC entre AT y VT, se realizó un ensayo de avidez para detectar cualquier diferencia en la avidez. AT (1,5 µg RTS,S + 50 µL AS01) y VT (1,6 µg RTS,S + 1,85 µL AS01) tuvieron títulos de ELISA similares y no mostraron diferencias significativas en la avidez (Figura complementaria 3a). Asimismo, los grupos AT1 (0,05 µg RTS,S + 50 µL AS01) y VT1 (0,18 µg RTS,S + 1,86 µL AS01) que tenían una protección similar ~50% no mostraron diferencias significativas en la avidez (Figura complementaria 3b). En general, la magnitud de los anticuerpos predijo en gran medida la protección y se requirieron títulos más altos para la protección en el régimen de AT adyuvante más alto en comparación con el VT.

Dado que el título de NANPx6 se asoció con el resultado de protección, la concentración de los principales anticuerpos repetidos necesarios para la protección se determinó mediante un ensayo de interferometría de biocapa sin etiquetas (BLI). La concentración media geométrica de anticuerpos NANPx6 en ratones protegidos (190 µg/mL en AT y 115 µg/mL en VT) fue mayor que en ratones no protegidos (78 µg/mL y 34 µg/mL, respectivamente) y, lo que es más importante, los ratones AT protegidos tenían una concentración de anticuerpos significativamente mayor que los ratones VT protegidos (Fig. 6b). Un análisis ROC de las concentraciones de anticuerpos repetidos principales de AT versus VT reveló que los límites protectores para AT1 y AT2 (204 y 179 µg/mL, respectivamente) eran más altos que los de VT1 y VT2 (122 y 79 µg/mL, respectivamente). ) (Figura 4 complementaria y Tabla 2). Dado que el método ROC supone que existe un título protector umbral, también modelamos la eficacia sobre los aumentos incrementales en la concentración de anticuerpos repetidos importantes (Fig. 6c-f). La protección versus NANPx6 µg/mL o título mostró un buen ajuste a la ecuación de Hill (rango R2 0,69–0,98), lo que confirma aún más la correlación de la protección con los principales anticuerpos repetidos. Los títulos de µg/ml y NANPx6 asociados con una eficacia del 50 % para AT (112 µg/ml y 46 900, respectivamente) fueron más altos que para VT (39 µg/ml y 18 400, respectivamente), lo que confirma que el umbral de anticuerpos protectores en VT fue menor que en AT. regímenes.

En el presente modelo de ratón se recapitularon múltiples observaciones clave de los estudios de vacunación RTS,S/AS01 en humanos. Los principales títulos de anticuerpos de unión repetida en ensayos con RTS,S en humanos se han asociado con protección47,48, y el nivel de protección disminuye a medida que disminuyen los títulos repetidos12. En ratones, RTS,S/AS01 provocó una fuerte protección esterilizante que se asoció con un umbral de título repetido importante descrito. Los niveles de protección disminuyeron tras la nueva exposición 9 semanas después de la primera exposición, lo que también correspondió a la disminución de títulos repetidos importantes. Collins y cols. han informado una titulación similar de dosis de RTS,S en la cepa de ratón Balb/c, pero mostraron una protección saturante contra la exposición a esporozoitos transgénicos, incluso con dosis de vacuna ultrabajas49. Las diferencias biológicas entre los parásitos transgénicos pueden ser un factor, pero la cepa de ratón C57Bl/6 generalmente se considera más difícil de proteger contra la malaria50. En comparación con los modelos que se basan en la carga de parásitos hepáticos como lectura51, la protección estéril puede ser una prueba muy estricta para comparar vacunas y anticuerpos monoclonales52. Nuestro modelo discernió claramente la superioridad del antígeno RTS,S basado en partículas sobre un antígeno FL-CSP soluble. Un ensayo de eficacia de fase 2 en curso con FL-CSP determinará cómo los datos de eficacia en ratones se traducirían en CHMI53 (manuscrito en preparación).

El antígeno RTS,S se tituló a un volumen de AS01 constante (AT) o se tituló proporcionalmente con volúmenes de AS01 variables (VT). Si bien el volumen de adyuvante no varió de forma independiente, el régimen VT contenía una dosis de adyuvante AS01 más baja que la AT. La inmunogenicidad y la protección en los grupos AT se saturaron con una dosis alta de antígeno, pero un fuerte efecto ahorrador de dosis de antígeno fue más evidente con dosis más bajas de antígeno. La inmunogenicidad y la protección se valoraron mejor en los grupos de dosis de VT, lo que resultó en una PD50 ~3 veces mayor que la de AT. Es posible que las diferencias entre los efectos de las dosis de AT y VT sean un artefacto del factor de escala entre ratones y humanos. Anteriormente, se demostró que 1/250 de una dosis humana de AS01 era tan eficaz como 1/10 de la dosis humana para estimular las respuestas de IFN-γ en ratones10. Si la dosis de adyuvante utilizada aquí es demasiado alta, la diferencia observada en los regímenes de AT y VT puede ser menos relevante para los seres humanos. Sin embargo, el refuerzo de anticuerpos, la protección estéril y las correlaciones de protección en ratones sugieren que estas observaciones deben tenerse en cuenta al diseñar futuros ensayos de CHMI. Nuestros datos exigen una optimización independiente de la relación estequiométrica del antígeno y el adyuvante para las vacunas humanas. En un sentido práctico, esto puede reducir el costo de la vacuna y mejorar la disponibilidad del producto.

El análisis ROC en el título de ELISA y µg/mL mostró que la concentración de anti-NANPx6 que se predijo que conferiría protección estéril fue ~3 veces o ~2 veces menor, respectivamente, para los experimentos de VT en comparación con los experimentos de AT. Este resultado sugiere que los anticuerpos inducidos por regímenes de AT con ahorro de dosis de antígeno fueron menos protectores por unidad en el modelo de ratón. Mostramos que la segunda vacunación en AT provocó niveles de saturación del título anti-NANPx6 y ningún aumento significativo después de la tercera inmunización. Bajo las condiciones experimentales probadas, no pudimos discernir una diferencia en la avidez de los anticuerpos de los grupos AT y VT. Dado que el mecanismo de protección de los anticuerpos contra los esporozoitos no está claramente definido, no sabemos si hubo diferencias mecanísticas entre la protección mediada por anticuerpos del régimen AT y VT. Es posible que las dosis más altas del adyuvante en AT condujeran a que una gran proporción de células plasmáticas productoras de anticuerpos 2 semanas después de la tercera vacuna se produjeran con la segunda vacunación en lugar de con la tercera. Mecanísticamente, Pallikkuth et al. han sugerido que la sobreestimulación de clones de células B y T de alta afinidad producidos durante la primera y segunda inmunizaciones mediante la administración rápida de una tercera dosis alta causa anergia y regula negativamente los efectos protectores54. Se ha pretendido que la presencia de niveles elevados de anticuerpos de unión repetida principal después de la segunda dosis en AT inhibe la inducción de anticuerpos repetidos principales maduros por afinidad mediante la tercera inmunización a través de un circuito de retroalimentación55. En humanos, una dosis de adyuvante más baja (particularmente para la segunda vacunación) puede mejorar el refuerzo después de la tercera y cuarta vacunación19. Los estudios futuros en ratones deben centrarse en comprender cómo las células T CD4+ específicas de CSP56, las células T auxiliares foliculares, las células dendríticas y la funcionalidad de los anticuerpos pueden alterarse mediante distintos regímenes de inmunización.

Si bien existen diferencias significativas en los resultados de protección observados en ratones y humanos, varios estudios clínicos han mostrado resultados de eficacia prometedores utilizando dosis reducidas. El fraccionamiento de la tercera dosis de RTS,S/AS01 mejoró la protección sin aumentar los títulos de anticuerpos22. A pesar de títulos más bajos, RTS,S a media dosis combinado con AS01E no mostró ninguna caída en la eficacia en comparación con grupos de dosis más altas en CHMI realizado 3 meses después de la última vacunación23. Además, el ensayo pediátrico R21/Matrix-M demostró que la protección con una dosis más baja de adyuvante Matrix M no fue significativamente diferente de un grupo con una dosis alta de adyuvante en un seguimiento de 6 meses, a pesar de que los títulos con la dosis más baja de adyuvante fueron aproximadamente la mitad. los de la dosis más alta. A pesar de la evidencia que sugiere los beneficios de reducir la dosis de la vacuna, nuestros datos también sugieren que mejorar la eficacia de la vacuna es más complejo que simplemente reducir la dosis de la vacuna. Por ejemplo, el resultado de protección más alto se logró en los grupos que contenían dosis más altas de antígeno y adyuvante, incluso dentro de los grupos de TV. A pesar de un umbral de anticuerpos protectores más bajo en los experimentos de VT, los experimentos de AT tuvieron una PD50 3 veces menor, lo que sugiere la necesidad de equilibrar la calidad de los anticuerpos con la potencia de la vacuna para las vacunas CSP en desarrollo57,58. RTS,S/AS01 es la única vacuna recomendada para la protección contra la malaria por P. falciparum en humanos, y establecer su eficacia como punto de referencia en un modelo murino de protección mediada por vacunas será útil para seleccionar vacunas mejoradas contra la malaria en el futuro. Establecer la dosis de la vacuna PD50 y el título umbral de anticuerpos protectores puede actuar como punto de partida para futuros estudios en ratones destinados a mejorar las vacunas actuales basadas en CSP.

Los procedimientos con animales se llevaron a cabo de conformidad con la Ley de Bienestar Animal y otros estatutos y regulaciones federales relacionados con animales y experimentos con animales y se adhieren a los principios establecidos en la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, Publicación de la NRC, edición de 2011. Los estudios con animales se realizaron según un protocolo aprobado por la IACUC.

Se adquirieron ratones C57Bl/6 de Charles River Laboratories (Holister, CA). GSK suministró RTS, S y AS01 y se almacenaron a -80 ° C y 4 ° C, respectivamente. 50 µL de AS01 contenían 2,5 µg de 3-O-desacil-4′-monofosforil lípido A (MPL) y 2,5 µg de Quillaja saponaria Molina, fracción 21 (QS-21) y liposoma. El FL-CSP soluble era una proteína circumsporozoito de P. falciparum recombinante de longitud casi completa (que contiene las regiones terminales C y N, con 19 repeticiones NANP y 3 NVDP en la región repetida) y se produjo utilizando buenas prácticas de fabricación40,59. RTS,S se formuló con el adyuvante según las instrucciones proporcionadas por GSK. Las formulaciones de FL-CSP en AS01 contenían 0,75 µg de CSP por 25 µl y se mezclaron 1:1 con una solución madre 2x de AS01. Todas las inmunizaciones se administraron por vía intramuscular en un volumen de 50 µl en la parte externa del muslo izquierdo a intervalos de tres semanas.

Para evaluar la protección inducida por la vacunación contra la malaria, los ratones fueron expuestos 2 semanas después de la tercera inmunización mediante una inyección intravenosa de 100 µl a través de la vena de la cola con 3000 esporozoitos transgénicos de P. berghei que expresaban P. falciparum CSP39. Los ratones fueron monitoreados diariamente desde los días 4 a 15 para detectar parasitemia mediante frotis de sangre. Los ratones que mostraron parasitemia en 2 días consecutivos se consideraron no protegidos y se sacrificaron. Nueve semanas después de la exposición inicial (11 semanas después de la tercera dosis), los ratones supervivientes fueron reexpuestos de la misma manera.

Cada ratón fue sangrado 3 semanas después de la primera y segunda inmunización y 2 semanas después de la tercera inmunización. Se utilizaron sueros para analizar los títulos de anticuerpos mediante ELISA. CSP de longitud completa (100 ng/pocillo), péptido NANPx6-C (100 ng/pocillo), Pf16, un péptido C-terminal biotinilado (EPSDKHIKEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTCGNGIQVRIKPGSANKPKDELDYANDIEKKICKMEKCS [100 ng/pocillo]) o antígeno de hepatitis BS purificado suministrado por GSK (100 ng /pocillo) en PBS se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos Immulon 2HB (Thermo Scientific, Rochester, NY). Para ELISA59, las placas se recubrieron durante la noche a 4 °C y se bloquearon al día siguiente durante 1 h con caseína al 1% en PBS. El suero se diluyó en serie y se añadió a la placa durante 2 h a temperatura ambiente. Luego se añadió anticuerpo secundario anti-IgG de ratón HRP (Southern Biotech, Birmingham, AL) durante 1 h. Las placas se desarrollaron con el sistema de sustrato de peroxidasa ABTS (KPL, Gaithersburg, MD) durante 1 h y la reacción se detuvo con una concentración final del 2,5 % de dodecilsulfato de sodio. Los lavados entre cada paso se realizaron con PBS + Tween20 al 0,05%. El título se calculó como la dilución que resultó en OD415 = 1,0 usando una regresión no lineal de 4 parámetros Gen5 (BioTek, Winooski, VT).

Las placas duplicadas se recubrieron con 100 ng/ml de péptido NANPx6 y se bloquearon utilizando caseína al 0,5 % y Tween-20 al 1 %. Los sueros se diluyeron 1:500 y alícuotas de 100 µl por pocillo se diluyeron 3 veces en la placa, después de 2 h de incubación, una de las placas se lavó con PBS y la otra con tiocianato de sodio 1 M durante 15 minutos. El ELISA restante se desarrolló como anteriormente. Los títulos se calcularon como la dilución que resultó en OD415 = 1,0 usando regresión no lineal de 4 parámetros Gen5 (BioTek, Winooski, VT) y el índice de avidez se calculó como la relación de títulos de OD = 1 para las placas lavadas con tiocianato de sodio y PBS.

Se utilizaron biosensores recubiertos con estreptavidina cargados con 0,45 µg/ml de péptido NANPx6 para obtener una curva estándar (desplazamiento de nm frente a µg/ml) utilizando una mezcla equimolar de 7 anticuerpos monoclonales de regiones repetidas humanas 317, 311 CIS43, MGG4, 663, 580. y 121052. El ensayo se realizó en un instrumento Octet Red96 (Sartorius, Freemont CA). Los sueros de ratón se diluyeron a 1:50 en tampón cinético (PBS, pH 7,5, Tween-20 al 0,002 % y BSA al 0,01 %) y los biosensores se configuraron en la línea base durante 120 s, se cargaron durante 180 s, se asociaron durante 300 s y se disociaron durante 300 s. Los datos se analizaron utilizando el software de análisis de datos ForteBio HT versión 12.0. Los sensorgramas se normalizaron con respecto al control de suero sin tratamiento previo combinado en cada placa mediante resta de señal.

Durante el estudio se aplicaron análisis descriptivos y de inferencia estadística. Las comparaciones de las medias de los títulos se realizaron mediante ANOVA (nivel múltiple) y se aplicó la comparación múltiple de Tukey para los resultados continuos. La comparación de los títulos en dos grupos se realizó mediante la prueba U de Mann-Whitney no apareada. Las diferencias estadísticamente significativas en las medias de los grupos se indicaron en cifras como * para el valor de P < 0,05, ** para el valor de P < 0,01, *** para el valor de P < 0,001 y **** para el valor de P < 0,0001. Para los resultados de protección estéril, se analizaron tablas de contingencia para el resultado binario y se utilizó la prueba exacta de Fisher para evaluar la homogeneidad. Para examinar el rendimiento de los resultados de los títulos de anticuerpos para predecir la protección, se analizaron los títulos 2 semanas después de la tercera vacunación utilizando curvas de características operativas del receptor (ROC). El área bajo la curva (AUC) se utilizó como métrica de evaluación para comprobar el rendimiento de la clasificación. Se utilizó la distancia más corta entre la curva ROC y el punto teórico de “100% de sensibilidad y 100% de especificidad” para determinar un título de corte ideal para los resultados de protección. Se utilizó un modelo logístico logístico de dos parámetros para estimar la dosis PD50 del antígeno (potencias relativas usando dosis frente a respuesta de protección entre los grupos AT y VT). El modelado se realizó utilizando la siguiente relación utilizando el sitio web de EZAnalytics (https://ce.ezanalytix.com; Londres, Reino Unido) y se utilizó SAS 9.4 para el análisis. x= dosis; b= pendiente; e = interceptar (PD50).

En otro análisis, los títulos individuales de los ratones se separaron en contenedores de concentraciones incrementales de anticuerpos (tamaño del contenedor de 25 µg/ml o título logarítmico de 0,33) y se calculó la protección para cada contenedor. La curva dosis-respuesta que mejor se ajusta entre el título de anticuerpos y el porcentaje de protección se modeló de acuerdo con la ecuación de Hill utilizando GraphPad Prism 9.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los datos brutos recopilados durante este estudio pueden estar disponibles previa solicitud.

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Agradecemos al Laboratorio de Serología de Malaria WRAIR por realizar ensayos ELISA. Agradecemos a Yannick Vanloubbeeck, Lode Scheurman, Margherita Coccia, Pascal Cadot y Opokua Ofori-Anyinam de GSK por su asesoramiento y revisión del manuscrito. Agradecemos a Arasu Balasubramaniyam, Laboratorio de Vacunología Estructural por su ayuda con el desarrollo del ensayo BLI. Agradecemos a Babak Bayat de GSK por la transferencia del antígeno RTS,S/AS01 y HepB S. Agradecemos a la Dra. Lorraine Soisson, USAID; COL Jason Regules, Subdivisión de Investigación y Desarrollo de Productos Biológicos; y a la Dra. Ripley Ballou (anteriormente GSK Vaccines, Rockville) por su orientación programática. Agradecemos al personal de la Subdivisión de Medicina Veterinaria de WRAIR por su ayuda con el manejo de animales; la División de Entomología de WRAIR para mantener y proporcionar los parásitos transgénicos necesarios para infectar a los mosquitos; y los Dres. Roberta Spaccapelo, Università degli Studi di Perugia y Andrea Crisanti, Imperial College London, por proporcionar la cepa del parásito transgénico. El financiamiento para WRAIR fue proporcionado por el Departamento de Defensa de EE. UU. y por la Oficina de Enfermedades Infecciosas, Oficina para la Salud Global, USAID, según los términos del Acuerdo Interagencial MVDP (AID-GHA-T-00-08-00007).

Estos autores contribuyeron igualmente: Christopher J. Genito, Katherine Brooks, Alexis Smith.

Laboratorio de Vacunología Estructural, Subdivisión de Investigación y Desarrollo de Productos Biológicos, Instituto de Investigación del Ejército Walter Reed, Silver Spring, MD, 20910, EE. UU.

Christopher J. Genito, Katherine Brooks, Alexis Smith, Emma Ryan, Kim Soto y Sheetij Dutta

Centro de Capacidades Habilitadoras, Instituto de Investigación del Ejército Walter Reed, Silver Spring, MD, 20910, EE. UU.

Yuanzhang Li

GSK, Rixensart, Bélgica

Lucile Warter

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Experimentos realizados: ER, KS, AS, CJG y KB; datos analizados: SD, CJG, YL y KB; planificó el estudio: SD y LW; escribieron el manuscrito inicial: SD y CJG Contribuyeron igualmente como coautores: CJG, KB y AS

Correspondencia a Sheetij Dutta.

El material ha sido revisado por el Instituto de Investigación del Ejército Walter Reed, GSK y la Agencia de los Estados Unidos para el Desarrollo Internacional. No existe objeción a su presentación y/o publicación. Las opiniones o afirmaciones contenidas en este documento son puntos de vista privados del autor y no deben interpretarse como oficiales ni como reflejo de puntos de vista verdaderos del Departamento del Ejército o del Departamento de Defensa. La investigación con animales se llevó a cabo bajo un protocolo de uso de animales aprobado por IACUC en una instalación acreditada por AAALAC International con una Garantía de Bienestar Animal de Servicios de Salud Pública y en cumplimiento de la Ley de Bienestar Animal y otros estatutos y regulaciones federales relacionados con animales de laboratorio. Lucile Warter es empleada del grupo de empresas GSK y posee acciones de GSK.

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Reimpresiones y permisos

Genito, CJ, Brooks, K., Smith, A. et al. El umbral de anticuerpos protectores de la vacuna contra la malaria RTS,S/AS01 correlaciona la dosis de antígeno y adyuvante en un modelo de ratón. npj Vacunas 8, 114 (2023). https://doi.org/10.1038/s41541-023-00714-x

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Recibido: 30 de enero de 2023

Aceptado: 01 de agosto de 2023

Publicado: 10 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41541-023-00714-x

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