Identificación rápida de Staphylococcus aureus basada en una plataforma de detección/imagen de fluorescencia que combina un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle y el teléfono inteligente

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 20655 (2022) Citar este artículo

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Las enfermedades asociadas a los alimentos representan una importante amenaza para la salud pública en los Estados Unidos. Los riesgos para la salud asociados con los patógenos transmitidos por los alimentos impulsan la necesidad de un seguimiento constante de los productos alimenticios. Un método eficiente que pueda diagnosticar rápidamente patógenos transmitidos por los alimentos será invaluable y tendrá una gran demanda. En este estudio, mostramos la viabilidad de una nueva plataforma de detección rápida basada en imágenes/detección de fluorescencia que combina un dispositivo de reacción de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) portátil y fácil de usar y un sistema de detección basado en un teléfono inteligente. La plataforma propuesta se utilizó para detectar Staphylococcus aureus, que es uno de los patógenos transmitidos por los alimentos más importantes, especialmente los productos lácteos. El protocolo completo es más rápido; la reacción se realiza en condiciones isotérmicas y se completa en 1 hora o menos. Los resultados experimentales muestran que los ensayos LAMP fueron diez veces más sensibles que la detección basada en PCR. El sistema de detección de teléfonos inteligentes propuesto fue capaz de detectar y cuantificar muestras de ensayo LAMP que contenían tres concentraciones diferentes de S. aureus desde 109 UFC/ml hasta 103 UFC/ml. El presente estudio de prueba de concepto demostró que esta plataforma ofrece un método portátil y fácil de usar para medir patógenos objetivo con amplificación LAMP.

Los patógenos transmitidos por los alimentos se definen como agentes biológicos que causan enfermedades transmitidas por los alimentos; pueden ser virus, bacterias y eucariotas como hongos, protozoos o helmintos1. Cada año, la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) informa los brotes asociados con patógenos transmitidos por los alimentos; por ejemplo, en 2020 informó la contaminación de Escherichia coli, Listeria monocytogenes y Cyclospora en brotes de trébol, hongos Enoki y ensaladas en bolsas, respectivamente (FDA 2020). Los riesgos para la salud asociados con los patógenos transmitidos por los alimentos impulsan la necesidad de un seguimiento constante de los productos alimenticios. Para la detección de patógenos microbianos, el método convencional es el crecimiento bacteriano en un medio de cultivo y luego en agar selectivo; a veces implica pruebas bioquímicas o serológicas. Este proceso tiene algunas desventajas porque requiere mucho tiempo, es laborioso y no es posible la detección de patógenos no cultivables2. Siguiendo la metodología convencional, la detección de E. coli O157 tarda alrededor de 3 días, Salmonella entre 4 y 6 días y Vibrio parahaemolyticus alrededor de 7 días3. Por ello surgieron nuevas técnicas que proporcionan resultados más rápidos, fiables y sensibles; Algunas de las más utilizadas son la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP). En PCR, el proceso de amplificación implica la repetición de tres pasos de temperatura. El primer paso corresponde a la desnaturalización de la doble cadena del ADN, el segundo paso implica la hibridación de los cebadores y el último es la extensión del ADN4. Después de 35 a 40 ciclos, es posible obtener miles o millones de copias a partir de una única copia de ADN como plantilla5.

Se han identificado diversos patógenos en los alimentos mediante PCR; entre ellos se encuentran E. coli6, Salmonella7, V. parahaemolyticus8, C. perfringens9 y L. monocytogenes10. Sin embargo, para realizar la PCR es necesaria una máquina de PCR y el producto debe cargarse en gel de agarosa, teñirse con colorante y visualizarse bajo luz ultravioleta11. Estas limitaciones hacen de la PCR una técnica difícil de utilizar en el campo.

Por otro lado, la técnica LAMP desarrollada por Notomi et al.12 amplifica el ADN mediante el uso de cuatro cebadores que reconocen seis secuencias distintas en el ADN diana. El protocolo completo es más rápido; la reacción se realiza en condiciones isotérmicas y se completa en 1 hora o menos13. Los patógenos transmitidos por los alimentos identificados mediante esta técnica son Salmonella14, S. aureus15, Campylobacter16 y L. monocytogenes17. En este estudio, demostramos que la reacción LAMP tiene una gran sensibilidad para detectar muestras de S. aureus con diversas concentraciones. La reacción LAMP se puede analizar mediante electroforesis en gel de agarosa u otros métodos de detección. Sin embargo, estas técnicas de detección post-amplificación requieren la apertura de los tubos de reacción, lo que aumenta el riesgo de contaminación de la muestra. Para reducir este riesgo, los productos de amplificación LAMP se pueden visualizar mediante señal de fluorescencia añadiendo diversos colorantes como SYBR verde, calceína, SYTO 9 o berberina18,19,20. Algunos tintes permiten la identificación de una muestra positiva o negativa a simple vista mediante el cambio de color. Por ejemplo, el uso de nanopartículas de oro en LAMP genera un cambio de color de transparente a rosa en reacciones positivas21. Por otro lado, el uso de azul de hidroxinaftol (HNB) muestra una coloración violeta en las reacciones negativas en comparación con una coloración azul en las positivas19. Otro método de detección es el análisis de la turbidez derivada de la precipitación del pirofosfato de magnesio, que es el subproducto de las reacciones LAMP22. En este estudio, demostramos que la aplicación de tintes como HNB, que se puede ver a simple vista, y el tinte SYBR Safe, que solo necesita una luz azul para verse, es una manera fácil de distinguir visualmente entre resultados positivos y negativos.

Sin embargo, la evaluación del cambio de color dependerá de la sensibilidad ocular del usuario al color. Por este motivo, existe la necesidad de desarrollar un dispositivo que ayude a interpretar cuantitativamente el resultado de forma rápida y precisa y que también reduzca problemas como los falsos positivos. En este estudio, desarrollamos una novedosa plataforma de detección rápida que combina un dispositivo de reacción LAMP portátil y fácil de usar y un sistema de detección basado en teléfono inteligente, que permite pruebas y diagnósticos en el punto de atención (POC). Este dispositivo rentable controla un módulo de calentamiento isotérmico de baja potencia y un módulo de excitación LED a través de un microcontrolador Arduino. El dispositivo contiene una cubeta de reacción para llevar a cabo la reacción LAMP en el calentador isotérmico y una cámara USB para tomar una imagen del reactivo dentro de la cubeta que está iluminada por un LED. La imagen capturada se procesa mediante una aplicación para teléfono inteligente desarrollada específicamente para este estudio.

Las cepas de Staphylococcus aureus y Serratia marcescens se cultivaron en caldo Luria-Bertani a 30 °C y se agitaron durante 24 h. Se empleó caldo MRS para generar la biomasa de Lactobacillus casei a 35 °C con agitación durante 24 h. Luego las células se centrifugaron a 5000 xg durante 10 min. Se descartó el sobrenadante y el sedimento se utilizó para realizar la extracción de ADN. Para llevar a cabo este objetivo se utilizó el kit GeneJet Genomic DNA Purification (Thermo Scientific) y se siguieron minuciosamente las instrucciones del proveedor. La calidad del ADN se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa y se cuantificó con Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). Además, se inoculó leche desgrasada con S. aureus en diferentes concentraciones; Las muestras se hirvieron durante 10 minutos y se centrifugaron a 10.000 xg. El sobrenadante se almacenó a 4 °C hasta su uso como plantilla de ADN en la reacción LAMP.

Para detectar S. aureus se diseñaron oligonucleótidos basados en el gen FemA (DQ352463.1). El diseño de los cebadores se realizó mediante el software Primer Explorer V5 (http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html). El conjunto de cebadores se dirigió a seis regiones del gen mediante un cebador interno directo (FIP), un cebador interno inverso (BIP) y dos cebadores externos (F3 y B3). El mejor conjunto de cebadores fue FIP 5′CAAAGCCATCATTCTCACGGGTA-ACTTTGTACAAAATCCATCATTGG3′, BIP 5′ACGACAATAACAAAGTAATTGCAGC-AACATAACTTCCCATAGTAGGA3′, F3 5′TTAACTGTTACCGAATTTGACA3′ y B3 5′CCATTACTGGACCACGATTC3′. Los oligonucleótidos fueron sintetizados por Eurofins Genomics. Una reacción LAMP típica consistió en 1 × WarmStart Master Mix (Biolabs), 1,6 μM de FIP y BIP y 0,2 μM de oligonucleótidos F3 y B3. Finalmente, se utilizaron varias concentraciones de ADN y UFC como plantilla en el volumen final de reacción de 25 μL. La mezcla se incubó en un baño de agua a 65 °C durante 45 min y luego se detuvo a 90 °C durante 10 min. Para la detección visual utilizamos 120 μM de HNB y 1 μL de tinte SYBR Safe (Invitrogen) que previamente se diluyó 1:10. Se incluyó tinte seguro SYBR durante la incubación de muestras para evitar cualquier contaminación y garantizar la cuantificación en un solo paso con el aparato. Los productos LAMP se visualizaron a través de gel de agarosa bajo un transiluminador de luz azul y a simple vista.

Desarrollamos una novedosa plataforma de detección rápida que combina un dispositivo de reacción LAMP portátil y fácil de usar (Fig. 1a) y el sistema de detección basado en teléfono inteligente (Fig. 3), que permite pruebas y diagnósticos en el punto de atención (POC). El dispositivo de reacción LAMP requiere un elemento calefactor para calentar la muestra del ensayo LAMP basado en fluorescencia en la cubeta hasta 65–70 °C. El módulo Peltier se utiliza como elemento calefactor en este dispositivo (ver Figs. 1b y 2b). El módulo Peltier es un elemento electrónico compacto basado en semiconductores que actúa como una bomba de calor.

(a) diseño 3D de un dispositivo de detección LAMP portátil; (b) esquema de la cubeta encerrada por el módulo Peltier.

(a) aparato impreso en 3D para la reacción LAMP, (b) soporte de cubeta calentado por el módulo Peltier.

El dispositivo contiene una placa de circuito impreso (PCB) alimentada por un microcontrolador Arduino Nano que permite que la unidad de calentamiento alcance y mantenga una temperatura específica y que el sistema notifique la finalización de la reacción LAMP. Se utilizan cuatro baterías recargables AA de 2500 mAh para alimentar la unidad de calefacción y la pantalla LED que muestra la temperatura, el nivel de carga de la batería y el mensaje de finalización de la calefacción. Estas baterías también alimentan un diodo emisor de luz (LED) para iluminar la cubeta que contiene la muestra de ensayo basada en fluorescencia. La Figura 2 muestra el aparato impreso en 3D para la reacción LAMP y el soporte de la cubeta. La señal de excitación del tinte fluorescente la proporciona un LED. El haz de luz pasa a través de la cubeta donde se absorbe una parte de la luz y se emite el resto. La emisión de luz es capturada por una cámara USB instalada dentro del dispositivo. Las cámaras USB tienen una distancia focal corta y son compatibles con Android. Las imágenes capturadas se cargan y analizan en una aplicación de teléfono inteligente para correlacionar la intensidad de la fluorescencia con la concentración de S. aureus.

Se desarrolló y utilizó una aplicación de software para teléfonos inteligentes para procesar imágenes y cuantificar el recuento bacteriano. La aplicación se puede utilizar de forma intuitiva y requiere una intervención mínima por parte de un usuario no capacitado. El algoritmo de la aplicación para la medición de señales fluorescentes implica capturar, almacenar y procesar la imagen de la muestra23. La información de color de la imagen se extrae y se compara con los valores de rojo, verde y azul (RGB) para ayudar al usuario a seleccionar el color de destino. El código fuente de la aplicación de Android se creó en el lenguaje Java de Android Studio. Una vez que la aplicación captura una imagen, se procesa el análisis de píxeles y se calcula y muestra el valor porcentual de píxeles coincidentes en toda la imagen, que se correlaciona con la concentración de ácido nucleico objetivo, y se muestra presionando el botón de análisis (Fig. 3). . La función principal de la aplicación es permitir al usuario definir el color de la luz fluorescente emitida que se utilizará para detectar el objetivo dentro de la muestra. Una vez que se toma una imagen, la aplicación permite al usuario interactuar con la imagen seleccionada y permite que el píxel tocado de la imagen determine el valor RGB. Se encuentran más detalles en la Referencia 23.

Imagen fluorescente de una muestra capturada por una aplicación de teléfono inteligente.

La cuantificación realizada con una nanogota de ADN genómico procedente de la extracción de S. aureus arrojó una concentración de 1480 ng/μL con una relación 230/260 de 1,82. La visualización del ADN en el gel de agarosa muestra que las muestras no están degradadas. Para evaluar la sensibilidad de LAMP, se probaron diferentes concentraciones de ADN, que van desde 1000 ng hasta 10 pg. Todas las concentraciones muestran bandas múltiples, lo que se espera con esta técnica a través de gel de agarosa (Fig. 4a). Con el tinte SYBR Safe, se observó fluorescencia verde-amarilla bajo luz azul en todas las muestras que contenían la plantilla de ADN en comparación con el control sin plantilla (NTC) que tenía un color naranja-amarillo (Fig. 4b). Por otro lado, las reacciones con colorante HNB muestran un color azul en las reacciones positivas y un color violeta en las negativas (Fig. 4c). La sensibilidad en la detección directa de S. aureus en muestras de leche inoculada se observó de 109 a 104 UFC/mL (Fig. 5).

Sensibilidad de amplificación LAMP. (a) Productos LAMP visualizados en gel de agarosa al 2% que contienen diferentes concentraciones de ADN genómico de S. aureus que oscilan entre 1000 y 0,01 ng. El marcador de tamaño del ADN se muestra en el carril más a la izquierda; y se muestra un control sin plantilla (NTC) en el carril más a la derecha. "M" indica "marcador de tamaño de peso molecular". (b) Productos LAMP con tinte seguro SYBR observados bajo luz azul en diferentes concentraciones de ADN. (c) Productos LAMP observados a simple vista con tinte HNB con diferentes concentraciones de ADN.

Sensibilidad de LAMP en muestras de leche. (a) Productos LAMP visualizados en gel de agarosa al 2%. El marcador de tamaño del ADN se muestra en el carril más a la izquierda; y se muestra un control sin plantilla (NTC) en el carril más a la derecha. "M" indica "marcador de tamaño de peso molecular". (b) Productos de amplificación LAMP con SYBR seguro como colorante observados bajo luz azul a partir de muestras de leche contaminadas con varias concentraciones de S. aureus (109–104 UFC/mL).

Para evaluar la especificidad de los cebadores, se emplearon como control ADN de Serratia marcescens y Lactobacillus casei. Ambas cepas muestran un color naranja en el tubo (Fig. 6), estos ensayos demuestran que los cebadores diseñados in-silico se dirigen a S. aureus y no hay detección cruzada con otras cepas bacterianas.

Especificidad de los cebadores LAMP para detectar S. aureus. Se desarrolló una reacción LAMP contra otras especies de bacterias para evaluar su especificidad contra S. aureus (Sa). En ambas bacterias analizadas no existe fluorescencia verde, lo que indica que no existe reacción cruzada con Serratia marcescens (Sm) y Lactobacillus casei (Lc); que muestran una coloración como la del tubo sin plantilla (NTC).

Utilizando el sistema de detección de teléfonos inteligentes propuesto, analizamos productos LAMP con varios niveles de carga bacteriana. Se realizaron experimentos para medir muestras del ensayo LAMP que contenían diferentes concentraciones de S. aureus (109 UFC/ml, 106 UFC/ml y 103 UFC/ml). Nuestra aplicación mostró los resultados de las pruebas de cuantificación de S. aureus mediante el tinte fluorescente. La Figura 7 muestra los porcentajes promedio de fluorescencia detectados en el ensayo. La aplicación acomoda muestras con una concentración de S. aureus de 103 a 109 UFC/mL, y es evidente que el porcentaje de fluorescencia y la concentración de S. aureus tienen una relación lineal. A partir del presente estudio de prueba de concepto, esta plataforma ofrece un método portátil y fácil de usar para medir la concentración de S. aureus con amplificación LAMP.

Porcentaje de fluorescencia (%) calculado por la aplicación del teléfono inteligente frente a la concentración de S. aureus del ensayo LAMP con el límite (línea de puntos roja).

Staphylococcus aureus es uno de los patógenos transmitidos por los alimentos más importantes y el control de S. aureus es un importante problema de salud pública, especialmente en los productos lácteos, donde se han identificado varios brotes de intoxicación alimentaria24. Staphylococcus aureus se puede introducir en casi todos los pasos de la producción. Por esta razón, es crucial implementar estrategias de seguridad alimentaria para evitar la contaminación en el manejo y procesamiento, así como monitorear y diagnosticar oportunamente todos estos pasos para garantizar un producto libre de patógenos.

Una de las preocupaciones más importantes sobre S. aureus es la producción de una amplia gama de toxinas que pueden provocar intoxicación alimentaria; sin embargo, la intoxicación alimentaria por estafilococos se produce cuando las poblaciones del patógeno superan las 105 células por gramo25. En este trabajo pudimos detectar una menor cantidad de células, lo que nos permite identificar S. aureus con precisión y rapidez antes de que alcance niveles tóxicos. Algunos de los elementos deseados en una técnica diagnóstica son su sensibilidad y rapidez en la obtención de los resultados. Desde que se desarrolló la técnica LAMP, se ha utilizado como una importante herramienta de diagnóstico. LAMP es relativamente fácil de realizar con alta sensibilidad. En este trabajo no pudimos detectar concentraciones de ADN inferiores a 10 pg utilizando este conjunto de cebadores. Sin embargo, en el trabajo previo de Sheet et al.26, LAMP detectó S. aureus utilizando cebadores basados en el gen nuc con una sensibilidad de 0,052 pg y 9 × 102 UFC/mL. El gen femA fue seleccionado debido a su alta conservación en aislados de S. aureus y su uso previo exitoso como marcador molecular en PCR y recientemente en LAMP27,28.

En este trabajo, el ensayo LAMP funciona con 0,01 ng de ADN. Un estudio anterior informa que 1 ng de plantilla de ADN o menos es esencial para la detección LAMP en comparación con la detección por PCR donde se necesitan 10 ng. Hace que LAMP sea 10 veces más sensible que la PCR. Sin embargo, LAMP es menos sensible que la PCR anidada y la qPCR29. Para comparar la sensibilidad de LAMP versus qPCR para detectar S. aureus, reproducimos el ensayo informado por Kim et al.30 con ADN genómico de S. aureus. Pudimos detectar 1 pg de ADN y calculamos un límite de detección (LOD) de 1,3 pg con qPCR. El resultado se puede encontrar en la información complementaria (Figura complementaria S1). Este análisis de sensibilidad mostró que qPCR era más sensible que LAMP para detectar ADN de S. aureus y UFC como plantilla, lo que concuerda con los resultados publicados30. Sin embargo, en términos de tiempo de reacción, las reacciones LAMP son muy rápidas (<60 min), ya que no se necesitan pasos de termociclado ni equipo especializado; y los resultados se pueden obtener en tan solo 15 min31.

Un problema común encontrado en los experimentos LAMP es la amplificación en el control negativo; Este problema se ha informado en investigaciones anteriores. Además, el cebado incorrecto en las reacciones LAMP puede dar lugar a interpretaciones incorrectas, como falsos positivos32. El proveedor recomienda realizar la estandarización de la reacción LAMP. Esto se puede hacer mediante la estandarización del pH, la pureza y la proporción de los oligonucleótidos, la concentración de colorante y ADN, así como la temperatura y el tiempo de reacción. Además, puede producirse contaminación cruzada al abrir las tapas del tubo de reacción. Para prevenirlo se ha propuesto el uso de cápsulas de agar33. Además, se deben tomar precauciones durante la preparación de la mezcla maestra. Por ejemplo, se recomienda trabajar en áreas separadas y el uso de micropipetas exclusivas para los experimentos LAMP, puntas con filtro, tubos libres de ADNasa y ARNasa y mantener limpia la estación de trabajo mediante el uso de lejía (Figuras complementarias S2 y S3).

La plataforma de detección y reacción LAMP de este proyecto ofrece monitoreo fluorescente de tubo cerrado que no requiere abrir el tubo después de la amplificación. La aplicación desarrollada y utilizada en este estudio calculó el valor porcentual de píxeles coincidentes en toda la imagen utilizando el valor RGB seleccionado de la señal fluorescente. Este valor porcentual se correlacionó con la concentración de carga bacteriana para la cual el coeficiente de determinación (R2) es igual a 0,986. Este estudio combina un algoritmo eficaz de procesamiento de imágenes codificado en una aplicación de teléfono inteligente con un aparato económico impreso en 3D que eliminó el monitoreo visual inexacto y permitió la cuantificación de la carga bacteriana y la concentración de ácido nucleico. La plataforma portátil de reacción y detección LAMP eliminará la necesidad de equipos de laboratorio dedicados al ciclo térmico para operar la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La presente amplificación en tubo cerrado elimina el riesgo de contaminación por arrastre y permite la cuantificación en tiempo real del ADN amplificado para análisis finales en tiempo real. A partir del presente estudio de prueba de concepto, esta plataforma basada en imágenes/detección de fluorescencia ofrece un método portátil y simplificado para medir patógenos objetivo con amplificación LAMP.

Los conjuntos de datos utilizados en este estudio están disponibles previa solicitud razonable de los autores correspondientes.

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Este trabajo cuenta con el apoyo de “ALFA-IoT-Alliance for Smart Agriculture in the Internet of Things Era” (Número de premio 2018-38422-28564) y la Iniciativa de Investigación Agrícola y Alimentaria-Área Prioritaria de Capacitación de la Fuerza Laboral Agrícola (Subvención N° 2021-67037 -10692/Proyecto No. de Acceso 1025548), del Departamento de Agricultura de EE. UU., Instituto Nacional de Alimentación y Agricultura. También agradecemos al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), México por su apoyo.

Departamento de Ciencias de la Familia y del Consumidor, Universidad Estatal de Nuevo México, Las Cruces, NM, 88003, EE. UU.

Patricia Cabrales-Arellano, Martha Minor y Efrén Thin

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Departamento de Tecnología y Gestión Industrial, Texas A&M University Kingsville, Kingsville, TX, 78363, EE. UU.

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Departamento de Ingeniería Mecánica e Industrial, Texas A&M University Kingsville, Kingsville, TX, 78363, EE. UU.

Heidi Taboada y José Espíritu

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Jianzhong Su

Departamento de Ingeniería Mecánica, Universidad Estatal de Nuevo México, Las Cruces, NM, 88003, EE. UU.

Parque Young Ho

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PC-A. y YHP escribió el texto principal del manuscrito; EP diseñó el cebador LAMP y realizó experimentos LAMP; El Departamento de Emergencias diseñó y supervisó experimentos generales; MM realizó pruebas PCR; DV-R., HT y JE diseñaron el dispositivo impreso en 3D; JS ayudó a desarrollar el algoritmo de la aplicación para teléfonos inteligentes.

Correspondencia a Young Ho Park.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Cabrales-Arellano, P., Park, E., Minor, M. et al. Identificación rápida de Staphylococcus aureus basada en una plataforma de detección/imagen de fluorescencia que combina el ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle y el sistema basado en teléfono inteligente. Representante científico 12, 20655 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25190-6

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Recibido: 25 de abril de 2022

Aceptado: 25 de noviembre de 2022

Publicado: 30 de noviembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25190-6

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