Cuantificación de la actividad metabólica de Ascaris suum L3 mediante reducción de resazurina

Parásitos y vectores volumen 16, número de artículo: 243 (2023) Citar este artículo

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Las infecciones por helmintos son un importante problema de salud pública en los seres humanos y tienen un impacto aún mayor en el bienestar de los animales domésticos y del ganado. Las lecturas actuales para los ensayos de detección de fármacos antihelmínticos son etapas de desarrollo, migración o motilidad que pueden ser subjetivas, laboriosas y de bajo rendimiento. El objetivo de este estudio fue aplicar y optimizar una técnica fluorométrica utilizando resazurina para evaluar cambios en la actividad metabólica de larvas de tercer estadio (L3) de Ascaris suum, un parásito de alta relevancia económica en cerdos.

Ascaris suum L3 eclosionaron mecánicamente a partir de huevos embrionados de 6 a 8 semanas y enriquecidos con gradiente de sacarosa. El colorante de resazurina y A. suum L3 se titularon en placas de microtitulación de 96 pocillos y la actividad de reducción de resazurina se evaluó mediante fluorometría después de 24 h de incubación. Se utilizó microscopía de fluorescencia para localizar el sitio de reducción de resazurina dentro de las larvas. Finalmente, expusimos A. suum L3 a diversas condiciones de estrés, incluido calor, metanol y antihelmínticos, e investigamos su impacto en el metabolismo de las larvas a través de la actividad de reducción de la resazurina.

Mostramos que el colorante no fluorescente resazurina se reduce dentro del vital A. suum L3 a resorufina fluorescente y se libera en los medios de cultivo. Los parámetros óptimos del ensayo son 100–1000 L3 por pocillo, una concentración de resazurina de 7,5 µg/ml y una incubación a 37 °C/5 % de CO2 durante 24 h. Una vaina L2 intacta alrededor de la L3 de A. suum impide por completo la absorción de resazurina, mientras que en la L3 desenvainada, la señal de fluorescencia más intensa se observa a lo largo del intestino medio larvario. L3 expuesta a metanol o calor muestra una actividad de reducción de resazurina gradualmente disminuida. Además, la exposición de 24 h a ivermectina a 0,625 µM, mebendazol a 5 µM y tiabendazol de 10 a 100 µM disminuyó significativamente la actividad metabólica de las larvas en un 55%, 73% y 70% a 89%, respectivamente.

En conjunto, nuestros resultados muestran que tanto los estresores metabólicos como los fármacos antihelmínticos reducen de manera significativa y reproducible la actividad reductora de resazurina de A. suum L3, lo que convierte al ensayo propuesto en un método sensible y fácil de usar para evaluar la actividad metabólica de A. suum L3 in vitro. .

El control de los nematodos gastrointestinales se basa principalmente en la quimioterapia tanto en humanos como en animales. Sin embargo, los tratamientos recurrentes y las reinfecciones, la limitación de las clases de fármacos antihelmínticos actualmente disponibles [49], el aumento de los informes sobre la eficacia reducida de los fármacos y la evolución de la resistencia a los antihelmínticos de primera línea, como los benzimidazoles y la ivermectina, aumentan la conciencia sobre la importancia de la investigación de los fármacos antihelmínticos [19, 22 , 30, 38]. El rápido descubrimiento de nuevos fármacos contra los helmintos transmitidos por el suelo (STH) se ve obstaculizado principalmente por la falta de métodos objetivos de detección de alto rendimiento para evaluar la eficacia de los fármacos [1, 20, 47].

La evaluación microscópica de la motilidad y la morfología domina los métodos utilizados actualmente para evaluar la eficacia de los fármacos en larvas. Estos enfoques en general requieren mucho tiempo, son laboriosos y propensos a la subjetividad, por lo que no son adecuados para la detección de alto rendimiento. Dispositivos como el sistema xCELLigence [40] y el sistema wMicroTracker™ [24, 37] han sido validados para la detección de drogas de alto rendimiento con Caenorhabditis elegans y algunas especies de helmintos parásitos, pero la lectura se limita completamente a la actividad de locomoción. Por lo tanto, se analizan enfoques combinatorios que abordan múltiples parámetros al seleccionar nuevos fármacos candidatos, como una lectura general como la actividad de locomoción combinada con una lectura específica para el modo de acción putativo, como la actividad electrofisiológica o metabólica [12].

Además de la motilidad, la viabilidad de los nematodos se puede evaluar utilizando colorantes indicadores de la actividad metabólica que los estadios larvarios convierten en un producto mensurable. Se han probado diferentes indicadores metabólicos para detectar helmintos, como el colorante de tetrazolio, bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), diacetato de fluoresceína (FDA), fosfato de paranitrofenilo (pNPP). ) [34], y el colorante permeable a las células resazurina. La resazurina se basa en la reducción de resazurina a resorufina dependiente de NADPH y se usa ampliamente para monitorear el crecimiento y el metabolismo de las células de mamíferos en una amplia gama de objetivos [23]. El ensayo de reducción de resazurina se ha adaptado hasta ahora para la detección de fármacos en especies adultas de Schistosoma [25, 26] y en larvas de cuarto estadio (L4) y adultos de Trichuris muris [39]. Hasta donde sabemos, los datos sobre el potencial del ensayo de reducción de resazurina en Ascaris spp. Falta el parásito, aunque es una de las geohelmintiasis más comunes en todo el mundo, tanto en humanos como en cerdos [15, 17, 51].

En este estudio, adaptamos y evaluamos el ensayo de reducción de resazurina para larvas de tercer estadio (L3) de Ascaris suum. Mostramos que la resazurina no fluorescente es absorbida por larvas viables sin vaina. La resazurina se reduce principalmente en el intestino medio de las larvas a resorufina fluorescente y se libera en el medio de cultivo. La exposición a antihelmínticos de uso común o condiciones que comprometen el metabolismo de A. suum L3 se evaluaron cuidadosamente y dieron como resultado cambios consistentes y graduales en la actividad de reducción de resazurina. Por lo tanto, el ensayo de reducción de resazurina es una herramienta prometedora para complementar los métodos comunes de detección de fármacos para detectar efectos directamente sobre la actividad metabólica de A. suum L3.

Se recolectaron gusanos adultos de A. suum cada dos meses en un matadero en Brandeburgo (Alemania) después del sacrificio. Las recolecciones se realizaron los días en que se sacrificaron principalmente animales orgánicos. Cada lote de gusanos contenía entre 100 y 300 gusanos de diferentes tamaños de diferentes cerdos. Los gusanos hembra móviles se separaron y se lavaron varias veces en una solución de NaCl al 0,9% precalentada (37 °C). Los gusanos se transfirieron a botellas de vidrio a una densidad de cuatro gusanos por 200 ml de solución salina equilibrada de Hanks suplementada con antibióticos (HBSS-AB: NaCl 127 mM, NaHCO3 7,5 mM, KCl 5 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM × 6 H2O), suplementado con 200 U/ml de penicilina, 200 μg/ml de estreptomicina, 2,5 μg/ml de anfotericina B y 50 μg/ml de gentamicina (PAN-Biotech GmbH, Alemania), y cultivados a 37 °C y 5% de CO2. Después de 24 h, los gusanos se transfirieron a un medio de cultivo fresco y los huevos excretados se recolectaron y recogieron en un filtro celular de 30 µm (Miltenyi Biotec) y se lavaron lavando el filtro con 50 ml de HBSS. Posteriormente, los huevos se embrionaron durante 6 a 8 semanas a 33 °C en 50 ml de agua destilada (dH2O) que contenía 0,1% de formaldehído y se protegieron de la luz. El estado de embrionación se evaluó microscópicamente.

Cada semana durante la embrionación (0 a 6 semanas), se tomó una muestra que contenía entre 10 000 y 30 000 huevos de A. suum para análisis de citometría de flujo utilizando un FACS Canto II (BD Biosciences) y el software BD FACSDiva v8.0. Sin tinción adicional, se registraron y evaluaron las propiedades de dispersión frontal (tamaño) y lateral (granularidad) de cada muestra utilizando el software FlowJo v10 (Tree Star).

Normalmente, las tasas de embrionación de A. suum varían entre el 50 y el 95 % después de 6 a 8 semanas de embrionación [10, 33] debido a algunos óvulos no fertilizados y a óvulos que permanecen sin desarrollarse en la suspensión de óvulos. Para superar esta heterogeneidad en el material de partida, se purificaron huevos de A. suum completamente embrionados utilizando un gradiente de densidad de sacarosa. Para reducir la pegajosidad de los huevos y la variación en la densidad de los huevos, se eliminó la capa uterina lavando los huevos tres veces con dH2O (200 x g a temperatura ambiente [RT] durante 2 min) y luego incubándolos en un baño de agua a 37 °C en HClO al 5% (dilución de 2,4 veces de solución madre de HClO al 12%) durante 5 min. Posteriormente, los huevos se lavaron cinco veces con 50 ml de albúmina sérica bovina (BSA) al 0,1% (200 xg a temperatura ambiente durante 2 minutos) y se resuspendieron en 5 ml de H2O dH. Se añadió un gradiente de sacarosa (18% (p/v), 20%, 23%, 25% cada 10 ml) utilizando la técnica del gradiente por etapas de capa inferior. El gradiente de sacarosa se centrifugó a 2000 xg a temperatura ambiente durante 1 h en un rotor oscilante (sin freno y con aceleración suave). Los óvulos completamente embrionados se recuperaron de la parte superior de las capas de sacarosa al 23 % y 25 % usando una jeringa de 20 ml con una aguja G20 × 2¾ ″, se lavaron cinco veces con HBSS-AB y se combinaron para su uso posterior.

Se transfirieron cuatro mililitros de suspensión de huevo purificada a un matraz Erlenmeyer de 100 ml que contenía 9 g de perlas de vidrio y se colocaron en un agitador (100 rpm, 37 °C) durante 30 minutos. Este tratamiento mecánico da como resultado tasas de eclosión de aproximadamente el 90%. Se recogieron A. suum L3 eclosionadas en un filtro celular de 30 µm, que luego se colocó en una placa de seis pocillos que contenía HBSS-AB y se incubó a 37 °C durante 3 h para permitir que las larvas viables migraran a través del tamiz. Después de la migración, se recogieron las larvas, se lavaron dos veces en HBSS-AB (200 xg a temperatura ambiente durante 2 minutos) y se contaron.

Se disolvió resazurina (Acros Organics BV, Bélgica) en HBSS-AB para preparar una concentración madre de 150 µg/ml. La solución madre se equilibró a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -20 °C para su uso posterior. Los espectros de emisión de fluorescencia de resazurina y resorufina se midieron con un fluorímetro (Cary Eclipse, Agilent).

Para valorar la concentración óptima de resazurina, se diluyeron en serie 15 µg/ml de solución madre de resazurina (ocho pasos de dilución doble) y se agregaron 10 µl de cada dilución a cada pocillo de una placa transparente de 96 pocillos de fondo plano, cada uno de los cuales contenía 500 A. .suum L3 en 90 µl de HBSS-AB. La placa se incubó a 37 °C/5% de CO2 durante 24 h y se detectó la intensidad de la fluorescencia a λem = 590 nm (Synergy H1, BioTek, λex = 540 nm). Para cuantificar la señal de fluorescencia generada por la reducción de resazurina dependiente de larvas, la lectura de fluorescencia se restó de un control inicial sin larvas de A. suum.

Para valorar el número óptimo de larvas, se preparó una dilución en serie doble con un rango de 1000 a cuatro A. suum L3/pocillo. Se añadió resazurina a cada pocillo a una concentración final de 7,5 µg/ml. La placa se incubó durante 24 h y la intensidad de la fluorescencia se determinó como anteriormente.

Para abordar los cambios inducidos por el calor en la actividad metabólica, se colocaron tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con 500 L3 en 500 µl de HBSS-AB en un baño de agua y se incubaron durante tiempos variables (1 a 8 min) a 60 °C y se dejaron reposar a RT durante 20 minutos antes de transferir L3 a una placa de 96 pocillos con un volumen final de 100 l/pocillo por triplicado. Se añadió resazurina a una concentración final de 7,5 µg/ml a cada pocillo. La placa se incubó a 37 °C/5% de CO2 durante 24 h y se midió la intensidad de la fluorescencia como se describe anteriormente. Para evaluar los cambios inducidos por el metanol en la actividad metabólica de las larvas, se incubaron 500 L3/pocillo a 37 °C y 5 % de CO2 durante 3 h en HBSS-AB que contenía 1,5, 3, 6, 12 o 25 % (v/v) de metanol. por triplicado. La placa se incubó durante 24 h antes de determinar la intensidad de la fluorescencia.

Para abordar los efectos del disolvente dimetilsulfóxido (DMSO) y los antihelmínticos sobre la actividad metabólica de las larvas, se probaron concentraciones de DMSO (Sigma-Aldrich, EE. UU.) que oscilaron entre el 0,5 y el 4 % (v/v) (concentraciones finales). Las concentraciones máximas solubles de los antihelmínticos se evaluaron mediante un ensayo de solubilidad turbidimétrico modificado [35]. Brevemente, las concentraciones madre de ivermectina (10 mM), mebendazol (10 mM) y tiabendazol (100 mM) en DMSO al 100% se diluyeron en serie en DMSO utilizando ocho pasos de dilución doble. Se transfirieron cinco microlitros de cada paso de dilución a 995 µl de H2O en una cubeta de 1 ml y se midió la turbidez a λ = 600 nm. Para los tratamientos antihelmínticos, se disolvieron ivermectina (Sigma-Aldrich, EE. UU.) a 6,25 µM y mebendazol (Sigma-Aldrich, EE. UU.) a 50 µM en DMSO al 5% (v/v) en HBSS-AB para preparar soluciones madre 10 veces mayores. Se disolvió tiabendazol (Sigma-Aldrich Corp., EE. UU.) a 1 mM, 0,1 mM y 0,01 mM en DMSO al 5% en HBSS-AB. Se añadieron diez microlitros de cada dilución de DMSO o solución madre de fármaco a los pocillos de una placa transparente de 96 pocillos de fondo plano, cada uno de los cuales contenía 500 A. suum L3 en 90 µl de HBSS-AB. Las placas se incubaron durante 24 h a 37 °C y 5% de CO2. A continuación, se añadieron a cada pocillo 5,3 µl de resazurina (conc. final 7,5 µg/ml) y las placas se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2 durante 24 h. La intensidad de la fluorescencia se detectó como se describe anteriormente.

Para evaluar el sitio de reducción de resazurina dentro de las larvas, se incubó A. suum L3 en HBSS-AB que contenía 7,5 µg/ml de resazurina a 37 °C y 5% de CO2 durante 3 h. Las larvas se lavaron tres veces con dH2O helada y se tomaron imágenes con un microscopio de fluorescencia (Axio Vert.A1 con Colibri 7, Zeiss) usando una longitud de onda de excitación de λex = 555 nm y un filtro de paso de banda de λem = 579-604 nm. Para verificar el bombeo faríngeo en A. suum L3 eclosionado, las larvas se incubaron en HBSS-AB que contenía 10 mg/ml de albúmina sérica bovina conjugada con fluoresceína (FITC-BSA; Thermo Fisher Scientific Inc., EE. UU.) durante 3 h y posteriormente se lavaron tres veces. en dH2O helada [7]. La fluorescencia se detectó utilizando una longitud de onda de excitación de λex = 475 nm y un filtro de paso de banda de λem = 500–525 nm (Axio Vert.A1 con Colibri 7, Zeiss).

Se utilizó GraphPad Prism 9 para el análisis de regresión y la comparación de grupos. Se utilizó un modelo de regresión lineal para los datos obtenidos del experimento de titulación de L3 y un modelo de regresión hiperbólica para los datos obtenidos del experimento de titulación de resazurina. Los parámetros de regresión se estimaron mediante el método de mínimos cuadrados. Los modelos de regresión se consideraron adecuados a los datos cuando R2 fue superior a 0,8. Se utilizó una prueba t de Student pareada para analizar la significancia estadística de la cantidad de resorufina liberada al medio por las larvas. Después de un simple análisis de varianza unidireccional (ANOVA), se utilizó la prueba de Dunnett para comparar los datos de intensidad de fluorescencia obtenidos de los experimentos en los que se midió el impacto del calor, metanol, DMSO y tiabendazol en L3. El impacto estadístico de la ivermectina y el mebendazol se analizó mediante una prueba t no pareada.

La embriogénesis continua de huevos de A. suum da como resultado una mezcla heterogénea de etapas de desarrollo, como huevos no fertilizados, huevos en etapa de 1 a 8 células o huevos completamente embrionados en un lote determinado. Mediante citometría de flujo, analizamos la mezcla de óvulos durante 6 semanas durante la embrionación. El análisis de las propiedades de dispersión hacia adelante y hacia los lados de estos huevos derivados de úteros femeninos grávidos reveló cambios graduales en la morfología del huevo, es decir, un aumento en el tamaño del huevo con una disminución concomitante de la granularidad (Fig. 1a, b). Con la hipótesis de que la granularidad del óvulo afecta la densidad del óvulo, utilizamos un gradiente de densidad de sacarosa de múltiples capas discontinuo [25% (p/v), 23%, 20%, 18%] para separar las diferentes etapas de embrionación de los óvulos. El gradiente de sacarosa fraccionó de manera reproducible las mezclas de huevos en cuatro capas distintas y un gránulo. La evaluación microscópica (Fig. 1c) reveló que los huevos recolectados de la parte superior de las dos capas superiores (18% y 20% de sacarosa) contenían principalmente estadios prelarvales, mientras que el sedimento consistía principalmente en huevos no fertilizados y algunas larvas ya eclosionadas. A su vez, tanto la capa de sacarosa de 23% como la de 25% albergaban huevos con larvas completamente desarrolladas en su interior y con una alta pureza > 95%. Es de destacar que las larvas dentro de los huevos que obtuvimos de las capas de sacarosa del 23% y del 25% parecían completamente embrionadas y, por lo tanto, se agruparon y utilizaron para todos los ensayos in vitro posteriores.

Purificación de huevos embrionados de A. suum mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. a Gráficos de dispersión de citometría de flujo ejemplares que representan las propiedades de dispersión directa (FSC-A) y lateral (SSC-A) de huevos no embrionados de A. suum en suspensión antes de la embrionación (izquierda) y una suspensión mixta de huevos después de 6 semanas de embrionación (derecha) . b Histogramas de mediciones semanales de FSC/SSC de huevos de A. suum desde la semana 0 a la semana 6 después del inicio de la embrionación. c Flujo de trabajo para separar huevos de A. suum completamente embrionados de huevos no desarrollados. La capa uterina se elimina antes de la purificación en gradiente. Las suspensiones de huevos mixtas se separan utilizando cuatro capas de sacarosa (18 % (p/v), 20 %, 23 % y 25 %) y los huevos se evalúan microscópicamente (barra de escala negra: 50 µm) para cada capa.

Dado que la viabilidad celular se puede medir mediante fluorometría como resultado de la reducción de resazurina a resorufina dependiente de la enzima diaforasa (Fig. 2a), nuestro objetivo fue analizar si esta reacción enzimática se puede aplicar para detectar la actividad metabólica de las larvas de A. suum. La longitud de onda de excitación de la resorufina está dentro del rango de 530 a 570 nm. Para nuestros experimentos, configuramos la longitud de onda de excitación en 540 nm y medimos los espectros de emisión de fluorescencia de la resorufina a λex = 540 nm para detectar la intensidad máxima de la señal de fluorescencia, que estaba en 590 nm (Fig. 2b).

Ascaris suum L3 reduce el colorante indicador metabólico resazurina. a Reacción bioquímica en la que el colorante no fluorescente resazurina (azul) se reduce a resorufina fluorescente (rosa). La reacción requiere la presencia de enzimas diaforasa y NADH/H+. b Espectros de emisión de fluorescencia de resazurina (curva discontinua azul) y resorufina (curva sólida rosa) en HBSS-AB a λex = 540 nm. c La titulación de resazurina de 0 a 15 µg/ml con un número fijo de 500 larvas de A. suum eclosionadas in vitro por pocillo muestra una relación hiperbólica (df = 7, R2 = 0,98, ½max de mejor ajuste = 1,6 µg/ml) . d La titulación de números de L3 de A. suum de 0 a 1000 L3 eclosionada in vitro con la concentración fija de 7,5 µg/ml de resazurina revela una fuerte correlación lineal (R2 = 0,99, ecuación: Y = 17,89x + 122,3, r = 0,99, con P < 0,0001). c, d Intensidad de fluorescencia medida en λem = 590 nm y λex = 540 nm. Los puntos negros representan la intensidad de la fluorescencia de pocillos individuales (n = 3 réplicas técnicas). La curva gris representa la curva de mejor ajuste (método de mínimos cuadrados)

Se realizaron ensayos de titulación para determinar los rangos óptimos tanto de la concentración de resazurina como del número de larvas de A. suum por ensayo. La concentración de resazurina se tituló de 15 a 0,06 µg/ml, con un número constante de 500 larvas por pocillo (Fig. 2c). Utilizando el método de ajuste de mínimos cuadrados, un modelo de regresión hiperbólica proporcionó el mejor ajuste con R2 = 0,98 (df = 7, RFU = 16.657, IC del 95 %: RFU = 14.574–19.104). Según la curva de regresión hiperbólica obtenida, la concentración de resazurina media máxima fue de 1,6 µg/ml (IC del 95 %: ½máx = 1,038–2,44 µg/ml). Sin embargo, una concentración de resazurina de 7,5 µg/ml proporcionó una mejor resolución de la señal con una intensidad de señal 1,83 veces más fuerte sin afectar visiblemente la motilidad de las larvas al mismo tiempo. Para valorar el número óptimo de larvas, realizamos una dilución en serie de 1000 a cuatro A. suum L3 con una concentración constante de resazurina de 7,5 µg/ml (Fig. 2d). Utilizando el método de ajuste de mínimos cuadrados, un modelo de regresión lineal simple proporcionó el mejor ajuste, con Y = 17,89x + 122,3. Además, el análisis de correlación de Pearson confirmó una fuerte relación lineal entre el número de larvas y la intensidad de la fluorescencia con r = 0,99 y P <0,0001. Determinamos que entre 100 y 1000 eran números óptimos de A. suum L3 utilizados en un ensayo de 96 pocillos.

Para evaluar si el producto fluorescente resorufina se acumula en las larvas o se libera en el medio, medimos la intensidad de la fluorescencia después de 24 h con A. suum L3 restante en los pocillos y la comparamos con los sobrenadantes de los que se había eliminado L3 (Fig. 3a). . Aunque nuestros datos revelaron una disminución en la intensidad de la fluorescencia entre ambas mediciones (prueba t pareada: n = 12, t = 3,774, df = 7, P = 0,0031), la intensidad media de la fluorescencia después de la eliminación de las larvas se redujo en un 3,8% en comparación con la Intensidad de fluorescencia media de muestras de medio con larvas presentes durante la medición. Por tanto, se detectó la gran mayoría de resorufina en el medio. Además, los sobrenadantes recolectados después de la incubación de 62, 125, 250 y 500 L3/96 pocillos durante 24 h no mostraron un potencial detectable para la reducción de resazurina a resorufina (Fig. 3b). Este último hallazgo indicó que la resazurina se reduce dentro de las larvas.

Ascaris suum L3 reduce la resazurina a resorufina y libera la mayoría a los medios. a Comparación de la intensidad de la fluorescencia antes y después de la eliminación de las larvas: se midieron 500 A. suum L3 por pocillo después de la incubación con 7,5 µg/ml de resazurina durante 24 h (+ larvas) y después de la eliminación de L3 (- larvas). Ambos grupos (n = 12 réplicas técnicas) se compararon mediante la prueba t pareada (t = 3,774, gl = 11, P = 0,0031). b Los productos excretor-secretores (ES) de A. suum L3 no convierten la resazurina en resorufina. Intensidad de fluorescencia de los sobrenadantes que contienen ES recolectados de 62, 125, 250 y 500 L3/pocillo después de la incubación con 7,5 µg/ml de resazurina durante 24 h. El diagrama de dispersión muestra la media y la desviación estándar (SD) (línea gris sólida) de unidades relativas de fluorescencia (RFU), los puntos negros representan RFU de pocillos individuales y la línea de puntos representa y = 0; n = 3 réplicas técnicas

A continuación, tomamos imágenes de A. suum L3 incubada con resazurina durante 3 h usando un microscopio de fluorescencia (Fig. 4a) para visualizar el tejido donde se produce la reducción de resazurina en las larvas. Dentro de A. suum L3, observamos una señal de fluorescencia brillante que se distribuía de manera desigual dentro del cuerpo larvario. Se emitió una señal brillante coherente desde una región dentro de las larvas en el extremo posterior, que, según las descripciones morfológicas de Kirchgäßner et al. [21], asignar al intestino medio de los gusanos. Las larvas incubadas sin resazurina no mostraron autofluorescencia a λex = 555 nm (Fig. 4b).

Localización de resorufina dentro de A. suum L3. a Configuración experimental para la localización de resorufina dentro de larvas vivas mediante microscopía de fluorescencia. b Larvas de control incubadas sin resazurina. c Adquisición de imágenes 3 h después de la adición de 7,5 µg/ml de resazurina. Imágenes de campo brillante (izquierda), fluorescencia (centro) y superposición (derecha) de resorufina dentro de L3 sin funda. Una vista ampliada de los extremos posterior y anterior de una larva no fluorescente que representa la cutícula L2 alrededor de L3 (puntas de flecha negras). Configuración de adquisición de imágenes: λex = 555 nm con un filtro de paso de banda para λem = 579–604 nm. Barra de escala negra: 100 µm, barra de escala amarilla: 40 µm, barra de escala blanca: 20 µm

Algunas larvas no mostraron ninguna señal de fluorescencia, aunque parecieron vitales y móviles durante todo el ensayo (Fig. 4c). Un análisis más detallado de la L3 no fluorescente reveló una vaina transparente y suelta visible en los extremos larvarios anterior y posterior (Fig. 4c, puntas de flecha negras). Por lo tanto, concluimos que la funda que Geenen et al. [11], denominada cutícula de L2 y que ocasionalmente permanece después de la segunda muda, así como después de la eclosión mecánica, previene la absorción de resazurina por parte de A. suum L3 viable.

El bombeo faríngeo de A. suum L3 eclosionado se verificó incubando las larvas con FITC-BSA. Se observó fluorescencia desde el extremo anterior y principalmente desde el intestino en larvas sin vaina, lo que indica una localización centrada en el intestino. Las larvas envainadas no exhibieron fluorescencia (archivo adicional 1: Fig. S1).

Naidoo et al. [27] han demostrado que la exposición temporal de huevos viables de A. suum a 60 °C durante varios momentos da como resultado una disminución gradual de la viabilidad del huevo, que se evaluó mediante la morfología y la motilidad. Además, se ha informado que la inhibición de la alimentación inducida por metanol tiene efectos graduales en concentraciones del 1 al 5% [18, 42] y un impacto letal para concentraciones de metanol a partir del 50% en C. elegans [8]. Por lo tanto, expusimos A. suum L3 al calor durante tiempos variables (Fig. 5a) y al metanol en concentraciones variables (Fig. 5b) para probar la capacidad del ensayo de reducción de resazurina para detectar diversos grados de daño de las larvas. Observamos que el tratamiento a 60 °C durante más de 3 min redujo significativamente la actividad metabólica de A. suum L3 en más del 93% (prueba de Dunnett, gl = 12, 3 min: q = 11,16, 5 min: q = 15,48, 8 mín: q = 16,22, P ≤ 0,0001). Tiempos de tratamiento más cortos (2 min) condujeron a una reducción del 50% (prueba de Dunnett, gl = 12, q = 4,226, P ≤ 0,01), mientras que 1 min de tratamiento a 60 °C no indujo cambios en la actividad metabólica de A. suum L3 (prueba de Dunnett, gl = 12, q = 0,055, P > 0,99). Para las larvas tratadas con 1,5% en volumen de metanol durante 24 h, no se detectó ningún impacto significativo en la actividad de reducción de resazurina. Sin embargo, se observó un deterioro gradual de la actividad reductora de resazurina en concentraciones del 3%, 6% y 12%, lo que resultó en señales de fluorescencia significativamente más débiles en un 20% (P ≤ 0,05), 45% (P ≤ 0,0001) y 70%. P ≤ 0,0001), respectivamente. El metanol al 25% anuló completamente la reducción de resazurina. En el control, el metanol en sí en concentraciones del 25% no cambió notablemente las características de fluorescencia de la resorufina (archivo adicional 2: Fig. S2). Se midió una disminución gradual en la producción de resorufina al aumentar las concentraciones de metanol. La regresión logística de cuatro parámetros reveló una concentración efectiva mitad máxima (CE50) = 6,8% (df = 26, R2 = 0,95, IC del 95% para CE50 = 4,3–9,2%) para metanol (archivo adicional 3: Fig. S3). En general, para A. suum L3 expuesto durante tiempos cada vez mayores a 60 °C o concentraciones crecientes de metanol, observamos una disminución gradualmente mensurable en la actividad de reducción de resazurina en las larvas.

El ensayo de reducción de resazurina permite cuantificar el deterioro metabólico. La actividad metabólica se evaluó para las larvas de A. suum después de un tratamiento térmico a 60 °C durante 0 a 8 min y una exposición a diferentes concentraciones de metanol durante 3 h utilizando el ensayo de reducción de resazurina. Los diagramas de dispersión representan mediciones de fluorescencia media (SD) de n = 3 réplicas técnicas por tratamiento. Los asteriscos indican significancia estadística según la prueba de Dunnett: *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,0001; ns: no estadísticamente significativo

Además, evaluamos el ensayo de reducción de resazurina con respecto a su capacidad para determinar los efectos de la exposición a fármacos antihelmínticos in vitro en A. suum L3 eclosionado. Dado que el DMSO se utilizó como disolvente farmacológico y se ha informado que afecta la viabilidad de las células de mamíferos ya en concentraciones bajas de 1 a 8% en volumen de DMSO [9], primero evaluamos los efectos del DMSO en el metabolismo de A. suum L3.

Para concentraciones de DMSO de 0,5% y 1%, el metabolismo larvario no se vio afectado significativamente al comparar las intensidades medias de fluorescencia de las larvas tratadas con las no tratadas utilizando la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Sin embargo, la intensidad de fluorescencia media se redujo en un 19,5% para el 0,5% (df = 10, q = 2,328, P = 0,124) y en un 17,2% para el 1% (df = 10, q = 2,05, P = 0,1907) de DMSO. Una concentración de DMSO del 2% resultó en una disminución significativa del 26% (df = 10, q = 3.163, P = 0.032) de la actividad metabólica de las larvas, mientras que exposiciones de hasta el 4% de DMSO dieron como resultado la inmovilización de las larvas y una disminución del 58% ( df = 10, q = 6,971, P = 0,0002) de la actividad de reducción de resazurina. Para reducir el impacto del DMSO en el metabolismo de las larvas, consideramos una concentración de DMSO del 0,5% para las siguientes pruebas de fármacos antihelmínticos.

Se observó una reducción significativa en la actividad metabólica de las larvas para los tres antihelmínticos en diferentes concentraciones. La exposición de las larvas a tiabendazol 1 µM resultó en una disminución no significativa en la actividad de reducción de resazurina en un 22,7% (prueba de Dunnett, df = 8, q = 2,207, P = 0,1354). El tiabendazol en concentraciones de 10 µM y 100 µM redujo significativamente la actividad de reducción de resazurina larval en un 70% (prueba de Dunnett, gl = 8, q = 6,771, P = 0,0004) y un 89% (prueba de Dunnett, gl = 8, q = 8,647, P < 0,0001) en comparación con el grupo no tratado, respectivamente. El mebendazol a 5 µM y la ivermectina a 0,625 µM redujeron significativamente la actividad de reducción de las larvas en un 73% (prueba t, t = 9, gl = 4, P < 0,0006) y un 55% (prueba t, t = 11,66, gl = 4, P < 0,003), respectivamente.

En el presente estudio, evaluamos el potencial del ensayo de reducción de resazurina para medir la actividad metabólica en A. suum L3. Dado que la reducción de resazurina intracelular depende de la actividad de las enzimas diaforasa [32], se ha utilizado ampliamente como indicador en ensayos de viabilidad, proliferación y toxicidad [2, 29, 31, 52]. Algunos estudios han informado sobre los intentos de utilizar el indicador redox resazurina para la detección de fármacos en helmintos, incluidas las especies de Schistosoma [25, 26], T. muris [39] y Ancylostoma ceylanicum [43]. Sin embargo, hasta donde sabemos, los datos que evalúan el ensayo de reducción de resazurina para A. spp. Falta L3, aunque pertenece, como Trichuris spp., a las geohelmintiasis más prevalentes en todo el mundo que afectan tanto a humanos como a animales [15, 51].

Nuestros resultados muestran que la resazurina se reduce dentro de las larvas de A. suum a la resorufina fluorescente. La producción de resorufina es directamente proporcional al número de A. suum L3, que también se ha descrito para esquistosomula [26]. Observamos que la saturación hiperbólica de la intensidad de la fluorescencia se produce al aumentar la concentración de resazurina, lo que es indicativo de una reducción de resazurina mediada por enzimas, por las enzimas diaforasa intracelular [32, 48]. Probablemente se pueda excluir la toxicidad inducida por resazurina a 7,5 µg/ml, ya que se informó que concentraciones de hasta 12,5 µg/ml no eran tóxicas para las células de mamíferos [23]. Sin embargo, observamos una motilidad reducida en A. suum L3 en concentraciones de resazurina superiores a 15 µg/ml, lo que necesita más investigación.

Además, nuestro objetivo era localizar el sitio en el que el parásito reduce la resazurina a resorufina. Consideramos la posibilidad de reducción de resazurina mediante productos excretores/secretores (ES) o el contenido de vesículas extracelulares. El sobrenadante que contenía ES de cultivos de A. suum L3 incubados con resazurina no mostró un aumento dependiente de la concentración en la intensidad de la fluorescencia, controlando la posibilidad de reducción de resazurina por productos de ES o contenidos de vesículas extracelulares que, según se informó, contenían enzimas metabólicas [13, 45]. Según las observaciones de la restricción de la absorción de FITC-BSA en A. suum L3 envainada (archivo adicional 1: Fig. S1) y la superposición espacial de las señales de fluorescencia de L3 incubadas con FITC-BSA o resazurina, asumimos que la resazurina se absorbe a través de la apertura bucal de las larvas desenvainadas en lugar de a través de la cutícula y la epidermis. Además, la presencia de larvas envainadas podría sesgar la evaluación de los ensayos de detección de drogas, especialmente cuando se centran únicamente en las lecturas de motilidad, ya que la cutícula puede afectar la absorción de drogas. Con base en esta observación e informes similares sobre L3 de Ancylostoma caninum y Heligmosomoides polygyrus [6, 7], sugerimos examinar cuidadosamente la frecuencia de larvas desenvainadas después de la eclosión para reducir un posible sesgo para los ensayos in vitro de A. suum L3. Alternativamente, podría ser posible normalizar los datos a la media de los controles del vehículo obtenidos dentro del mismo lote de larvas antes de comparar entre diferentes lotes.

A. suum L3 tratado térmicamente en nuestro estudio produjo gradualmente menos resorufina al aumentar el tiempo de exposición al calor, presumiblemente debido al deterioro de la actividad metabólica de las larvas inducido por el calor. Observamos una inactivación completa del metabolismo en larvas tratadas durante más de 3 minutos. Naidoo et al. informaron resultados similares. [27, 28], quienes observaron la inactivación de la viabilidad del óvulo y daño visible en el óvulo después de 3 minutos de exposición a 60 °C. Además, evaluamos el impacto del metanol en A. suum L3 para concentraciones de hasta 25% en volumen utilizando el ensayo de reducción de resazurina. De acuerdo con las observaciones de Jones y Candido [18], nuestros resultados muestran efectos tóxicos que aumentan gradualmente sobre la actividad metabólica de las larvas en concentraciones de metanol del 3 al 12% y una inactivación metabólica casi completa al 25%. Sin embargo, nuestros hallazgos muestran que A. suum L3 es más susceptible al metanol que C. elegans, ya que el valor LC50 de 24 h informado del 12 % para C. elegans es dos veces mayor que el de A. suum L3 con 6,8 % de metanol ( Archivo adicional 3: Fig. S3). En conclusión, el ensayo de reducción de resazurina se puede utilizar para medir la actividad metabólica de A. suum L3 y ayudar a detectar cambios sutiles del metabolismo cuando se aplica estrés físico o químico. Sin embargo, dado que el ensayo mide el potencial de reducción general de 100 o más larvas, aún es necesario investigar si la disminución de la fluorescencia observada se debe a una subpoblación de larvas muertas o a un deterioro metabólico de toda la población de larvas inicial después del estrés aplicado. Además, se debe garantizar que el agente a probar no tenga propiedades reductoras fuertes y no cambie el valor de pH del medio utilizado para evitar la sobresaturación de la señal de fluorescencia y/o mediciones erróneas (Fig. 6).

Ensayo de reducción de resazurina en pruebas de drogas. Las larvas se expusieron a antihelmínticos durante 24 h, tras una incubación con 7,5 µg/ml de resazurina durante 24 h. Las intensidades relativas de fluorescencia se midieron fluorométricamente para larvas tratadas con DMSO de 0 a 4% en volumen. b Tiabendazol en DMSO al 0,5% aplicado de 0 a 100 µM. c Ivermectina en DMSO al 0,5% aplicada a 625 nM. d Mebendazol en DMSO al 0,5% aplicado a 5 µM. Los diagramas de dispersión representan la intensidad media de fluorescencia (λex = 540, λem = 590) para n = 3 réplicas técnicas. Los asteriscos indican significación estadística mediante la prueba de Dunnett para DMSO y tiabendazol y mediante la prueba t para ivermectina y mebendazol: *P ≤ 0,05, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001; ns: no estadísticamente significativo. Todos los ensayos de fármacos se repitieron de forma independiente utilizando A. suum L3 eclosionado in vitro de diferentes lotes.

Además, evaluamos el ensayo de reducción de resazurina por su capacidad para evaluar los efectos de los fármacos antihelmínticos en A. suum L3. Probamos ivermectina, mebendazol y tiabendazol, ejemplos destacados de las clases de fármacos lactona macrocíclica y bencimidazol utilizados principalmente para la quimioterapia antihelmíntica y eficaces contra la ascariasis en humanos y cerdos [4, 5, 41, 46]. Dado que estos antihelmínticos tienen propiedades de solubilidad muy pobres en soluciones acuosas, se agrega principalmente DMSO para aumentar la solubilidad. Sin embargo, se han informado efectos tóxicos del DMSO del 2% al 4% en células de mamíferos [9]. Por lo tanto, investigamos el impacto del DMSO para concentraciones de volumen de hasta el 4% y encontramos que el límite de las concentraciones de DMSO que no afectan significativamente el metabolismo larvario es del 0,5 al 1%. El efecto in vitro de la ivermectina sobre las larvas de A. suum se evaluó previamente mediante ensayos de motilidad y migración [14, 16]. Hu et al. [16] informaron para la ivermectina un valor alto de CI50 de > 1,14 mM en A. suum L4 (aislados intestinales 14 días después de la infección). Sin embargo, no pudimos reproducir una concentración de ivermectina de 1,14 mM sin precipitación del fármaco en DMSO al 0,5%. Por lo tanto, valoramos la ivermectina en DMSO al 0,5% (en H2O) y detectamos turbidimétricamente su solubilidad máxima a 1,56 µM en H2O (archivo adicional 4: Tabla S1). Además, la solubilidad de la ivermectina en HBSS-AB fue menor debido a los componentes del medio como sales, azúcar y antibióticos, que redujeron la concentración soluble máxima a 625 nM. Con esta concentración de ivermectina, observamos una reducción del 55% en la actividad de reducción de resazurina en L3, lo que en consecuencia indica un valor de EC50 considerablemente más bajo para A. suum L3 que para A. suum L4 observado por Hu et al. [dieciséis]. Hansen et al. [14] informaron para la ivermectina una CI50 de ~ 1 µM en A. suum L3, que se acerca más a nuestras observaciones. Sin embargo, para C. elegans, se observaron efectos significativos a concentraciones de ivermectina considerablemente más bajas (0,6 a 20 nM de ivermectina) [3, 12]. Por un lado, esto puede indicar que el ensayo de reducción de resazurina es menos sensible para detectar los efectos de la ivermectina en A. suum L3 en comparación con los ensayos in vitro en otros nematodos. Por otro lado, junto con las observaciones de Hu et al. [16] y Hansen et al. [14], es concebible que las larvas de A. suum sean menos susceptibles a la ivermectina que las larvas de C. elegans. Hasta ahora, Zhao et al. han investigado el impacto del tiabendazol y el mebendazol en A. suum L3. [50], quienes informaron valores de CE50 en el rango de 2,3 a 150 nM utilizando un ensayo de migración en agar para la evaluación del efecto del fármaco después de 24 h de tratamiento farmacológico. Sin embargo, concentraciones 1000 veces mayores de estos antihelmínticos dieron como resultado una inactivación significativa, pero no completa, de la actividad reductora de resazurina entre un 73% y un 89% en el presente estudio. La comparación directa de los estudios es difícil porque los efectos de los medicamentos se evaluaron utilizando diferentes métodos. Sin embargo, el ensayo de reducción de resazurina podría ser menos sensible para detectar alteraciones de la locomoción de las larvas que el ensayo de migración en agar, pero podría proporcionar una mejor sensibilidad para detectar alteraciones de la actividad metabólica de las larvas.

Las tasas de embrionación de los huevos de A. suum pueden variar de un lote a otro, lo que da como resultado una solución de huevos heterogénea, que comprende huevos infértiles, no embrionados y completamente embrionados [10, 33]. Si las larvas parcialmente desarrolladas permanecen en la población final, esto podría sesgar los resultados de detección de fármacos en los ensayos de motilidad, migración o actividad metabólica. Por lo tanto, la sincronización de una etapa particular de desarrollo larvario es una solución para minimizar la variabilidad de cualquier ensayo que involucre larvas de nematodos, como se describe para el nematodo de vida libre C. elegans [36]. Sin embargo, hasta donde sabemos, estos enfoques en A. suum L3 no se han investigado. Utilizando un gradiente de densidad de sacarosa de múltiples capas discontinuo, separamos y enriquecimos huevos de diferentes etapas de desarrollo a partir de una solución de huevos heterogénea. Curiosamente, los huevos completamente embrionados obtenidos de ponedoras con 23% y 25% de sacarosa mostraron una morfología similar y típica de L3 [44]. Se requieren más investigaciones para examinar las posibles diferencias entre esos dos tipos de densidad de huevos.

En conclusión, este estudio estableció el ensayo de reducción de resazurina para la cuantificación de la actividad metabólica en A. suum L3 y demuestra por primera vez un enfoque sencillo para el enriquecimiento de huevos de A. suum completamente embrionados. El ensayo de reducción de resazurina puede detectar cambios metabólicos graduales de A. suum L3 después de la exposición a factores estresantes físicos y químicos, incluidos los principales fármacos antihelmínticos. El ensayo es económico y simple y, cuando se usa correctamente, puede impulsar la detección de drogas de rendimiento medio. Además, puede proporcionar información sobre la actividad metabólica general de las larvas. El ensayo de reducción de resazurina tiene un excelente potencial para complementar los ensayos disponibles para la detección de efectos de fármacos y tiene particularmente la ventaja de reducir un posible sesgo de lectura y avanzar en enfoques de detección combinatoria más simples para supuestos antihelmínticos, que en última instancia pueden acelerar el descubrimiento de fármacos antihelmínticos.

Todos los datos que respaldan las conclusiones de este artículo se incluyen dentro del artículo y sus archivos adicionales.

Albúmina de suero bovino

Agua destilada

Excretor/secretor

diacetato de fluoresceína

Albúmina sérica bovina conjugada con fluoresceína

Solución salina equilibrada de Hank suplementada con antibióticos

Larvas de tercer estadio

Larvas de cuarto estadio

Bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio

fosfato de para-nitrofenilo

Helmintos transmitidos por el suelo

Concentración de volumen

Concentración de masa

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Agradecemos a Beate Anders, Christiane Palissa, Bettina Sonnenburg e Yvonne Weber del Instituto de Inmunología (Freie Universität Berlin, Berlín, Alemania) por la recolección de óvulos y gusanos adultos, apoyo metodológico y asistencia técnica, y a Anne Winkler (Instituto de Inmunología, Freie Universität Berlin, Berlín, Alemania) por soporte gráfico.

Reconocemos la financiación de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) dentro de los proyectos GRK 2046: Infecciones parasitarias: de modelos experimentales a sistemas naturales (número de proyecto 251133687) de FE, SH y JK.

Instituto de Inmunología, Departamento de Medicina Veterinaria, Universidad Libre de Berlín, Berlín, Alemania

Arkadi Kundik, Zaneta D. Money, Susanne Hartmann y Friederike Ebner

Instituto de Parasitología y Medicina Veterinaria Tropical, Departamento de Medicina Veterinaria, Freie Universität Berlin, Berlín, Alemania

muletas Jürgen

Instituto Leibniz para la Investigación de Zoológicos y Vida Silvestre, Berlín, Alemania

Thomas Hildebrandt

Instituto Max-Born, Berlín, Alemania

Oleg Kornílov

Cátedra de Patogénesis de Infecciones, Departamento de Ciencias Biológicas Moleculares, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Técnica de Munich, Munich, Alemania

Friederike Ebner

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Conceptualización: AK, FE y SH; metodología: AK, FE, SH, JK, TH y OK; validación: AK; análisis formal: AK; investigación: AK, ZDM; recursos: SH; curación de datos: AK; redacción de manuscritos: AK, revisión y edición de manuscritos: AK, FE, SH, JK, TH, OK, ZDM; visualización: AK; supervisión: FE, SH, TH, OK; Adquisición de financiación: FE, SH, TH, OK.

Correspondencia a Friederike Ebner.

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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A. suum L3 sin funda ingiere albúmina sérica bovina conjugada con fluoresceína (FITC-BSA). Se exhibe una fuerte fluorescencia en el intestino medio (izquierda) y la abertura bucal (derecha). b L3 que lleva una vaina intacta (izquierda, indicada por una punta de flecha negra) no muestra fluorescencia (derecha). Configuración de adquisición de imágenes: λex = 475 nm con un filtro de paso de banda para λem = 500–525 nm. Barra de escala blanca: 20 µm. Barra de escala amarilla: 40 µm.

Espectros de emisión de fluorescencia de resorufina diluida en H2O y metanol (MeOH) al 25% a 540 nm. La curva negra discontinua (pico a 585 nm) representa el espectro de emisión medido de resorufina diluida en H2O, y la curva negra sólida (pico a 587 nm) representa el espectro de emisión medido de resorufina diluida en MeOH al 25 %.

Impacto del metanol (MeOH) en la actividad metabólica de A. suum L3. Las larvas (500 L3/96 pocillos) se expusieron durante 3 h a diferentes concentraciones (v/v) de MeOH, y se midió la intensidad de fluorescencia relativa de la resorufina después de la incubación con 7,5 µg/ml de resazurina durante 24 h. Se utilizó un análisis de regresión logística de cuatro parámetros sobre la concentración de MeOH transformada con log10 para interpolar la curva de respuesta a la dosis (línea negra continua; gl = 26, R2 = 0,95). EC50 de mejor ajuste = 6,8 % (IC del 95 % = 4,3–9,2 %). Los puntos negros representan medias aritméticas y los bigotes corresponden a la desviación estándar de n = 3 réplicas técnicas. Coordenadas trazadas utilizando una escala logarítmica de base 2 en el eje x y una escala lineal en el eje y.

Concentraciones solubles máximas de ivermectina, mebendazol y tiabendazol en DMSO al 0,5% determinadas mediante ensayo de solubilidad turbidimétrico.

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Reimpresiones y permisos

Kundik, A., Investor, ZD, Krücken, J. et al. Cuantificación de la actividad metabólica de Ascaris suum L3 mediante reducción de resazurina. Vectores de parásitos 16, 243 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05871-5

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Recibido: 25 de enero de 2023

Aceptado: 04 de julio de 2023

Publicado: 19 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05871-5

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