Caracterización preclínica de la eficacia y seguridad del N biológico.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11778 (2023) Citar este artículo

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La inhibición de la remodelación de actina en los nervios modula la propagación del potencial de acción y, por lo tanto, podría usarse para tratar el dolor agudo. N-001 es un nuevo analgésico proteico diseñado a partir de varias toxinas de C. botulinum. N-001 se dirige a las neuronas sensoriales mediante la unión del gangliósido GT1b y los ribosilatos de ADP-actina G que reducen la remodelación de la actina. La actividad y eficacia de N-001 se evaluaron previamente in vitro y en un modelo de dolor inflamatorio en ratón. Para evaluar la relevancia de N-001 para el tratamiento del dolor posquirúrgico agudo, el estudio actual evaluó la eficacia de N-001 en un modelo de incisión en la pata trasera de un ratón mediante la administración de bloqueo del nervio periincisional y poplíteo combinado con pruebas mecánicas. N-001 proporcionó alivio del comportamiento similar al dolor durante 3 días y 2 días más que la bupivacaína, un anestésico convencional de acción prolongada. Los estudios de seguridad preclínicos de N-001 indicaron que el fármaco no produjo reacciones inmunológicas tóxicas o adversas en dosis múltiples en ratones. Estos resultados, combinados con resultados de focalización anteriores, alientan una mayor investigación del N-001 como analgésico para el tratamiento del dolor posoperatorio con el potencial de funcionar como un bloqueo nervioso diferencial específico de los nociceptores.

El dolor posoperatorio se define como el dolor presente en un paciente después de la cirugía1. El dolor posoperatorio mal controlado puede provocar una estancia hospitalaria prolongada, complicaciones y una rehabilitación deficiente2. Esto puede provocar dolor crónico si el dolor agudo se prolonga y puede reducir la calidad de vida. El uso de analgesia con opioides sigue siendo el pilar del tratamiento del dolor posoperatorio3 y ha llevado a un uso excesivo de opioides para controlar el dolor, especialmente durante enfermedades crónicas, con un impacto significativo en los resultados clínicos4,5. La epidemia de opioides es una de las mayores crisis de salud pública que enfrenta Estados Unidos6. Cada día se producen más de 125 muertes por sobredosis de drogas, lo que supone una carga socioeconómica para el sistema sanitario7,8,9,10. El mercado posoperatorio global se está expandiendo rápidamente debido al aumento del número de procedimientos quirúrgicos, la gravedad del dolor posoperatorio y la adopción del manejo del dolor en los países emergentes11. Por lo tanto, es vital explorar otras opciones de tratamiento sin opioides para controlar el dolor12,13.

Las terapias basadas en proteínas son alternativas viables a los opioides convencionales y pueden ayudar a abordar la crisis de opioides14,15. Se están estudiando varios péptidos que se dirigen a canales iónicos, receptores nicotínicos neuronales (nAChR), canales de receptores potenciales transitorios (TRP) y diferentes receptores acoplados a proteína G no opioides (GPCR)16,17,18,19. El principal desafío de estos fármacos es su falta de especificidad, lo que conduce a un efecto fuera de objetivo combinado con un efecto limitado debido a su rápida eliminación20,21. Un componente clave del dolor inflamatorio es la actina citoesquelética (actina F) dentro de las neuronas sensoriales, que ayuda a la plasticidad estructural y funcional22,23. Reducir el contenido de actina F de la neurona sensorial cambiando la cinta de actina podría bloquear la señalización del dolor al limitar la actividad del canal iónico. Anteriormente hemos demostrado el diseño y uso de una nueva proteína recombinante (N-001) como candidato a analgésico del dolor inflamatorio in vitro e in vivo24,25. N-001 es una proteína recombinante diseñada a partir de varias toxinas de Clostridium botulinum. La proteína está compuesta de C2II-C1 rediseñado de la toxina C2 con un dominio C-terminal sustituido de la toxina C1 que es responsable de la unión y translocación del componente activo llamado C2I25. C2I es una ADP ribosilasa que modifica postraduccionalmente la actina G 26,27. N-001 está dirigido específicamente a las neuronas sensoriales, como se demuestra in vitro mediante la captación selectiva por parte de las neuronas sensoriales y no de las neuronas motoras24,25. Además, se ha descubierto que la eficacia in vivo del C2C funciona contra el dolor agudo asociado a nociceptores sin afectar la función motora24,25. Además, su gran tamaño y su administración local reducen la difusión e impiden la participación del sistema nervioso central24,25. Estas características lo convierten en un candidato potencial atractivo para su uso como analgésico posoperatorio.

Anteriormente se ha demostrado que N-001 inhibe los procesos necesarios para la señalización neuronal in vitro24. Los anestésicos bloquean las funciones de los canales iónicos para inhibir la producción de un potencial de acción necesario para la señalización del dolor28. Se ha demostrado que N-001 inhibe la entrada de calcio a través de la despolimerización de actina24 y, por lo tanto, exhibe una acción similar a la de un anestésico. Si bien los anestésicos locales son agentes nociceptivos eficaces para el control del dolor, producen efectos secundarios graves que incluyen pérdida de la función motora, entumecimiento e hipotensión29. Un bloqueo nervioso diferencial específico de la nocicepción solucionaría este problema. Un derivado de lidocaína con una capacidad reducida para la entrada de neuronas, QX-314, se combinó con agonistas del canal nociceptor específico TRPV30. El agonista de TRPV se unió específicamente a los canales de TRPV para promover la entrada selectiva del derivado en los nociceptores30. Si bien esta combinación tuvo eficacia selectiva contra los nociceptores30,31,44, la neurotoxicidad y la duración limitada limitaron su utilidad44. En los estudios aquí reportados, la especificidad y eficacia del nociceptor in vivo de N-00124,25 impulsaron intentos de evaluar su utilidad como agente de bloqueo nervioso diferencial específico de la nocicepción.

Nuestros estudios anteriores demostraron que N-001 alivió comportamientos similares al dolor en el modelo de formalina de ratón, lo que sugiere que N-001 podría mostrar eficacia contra otras formas de dolor. Para determinar la relevancia del tratamiento con N-001 para el manejo del dolor posoperatorio, el fármaco se probó en un modelo de incisión en la pata trasera de un ratón mediante la administración de bloqueo del nervio periincisional y poplíteo combinado con pruebas mecánicas.

N-001 redujo la alodinia y mejoró la marcha en ratones macho C57Bl/6 J (Fig. 1A). Se observó un alivio significativo del comportamiento similar al dolor medido por la prueba de Von Frey para N-001 y bupivacaína después de 2 y 6 h. Sin embargo, la eficacia continuó con N-001 durante un período significativamente más largo que con bupivacaína tanto a las 24 como a las 72 h. Ninguno de los fármacos tuvo efecto después de 168 h. Se observó un patrón similar con respecto a la marcha, donde N-001 mostró un beneficio significativamente mayor que la bupivacaína después de 1 día y 3 días en relación con el portador únicamente (Fig. 1B).

(A) Umbral de retirada de la pata trasera de ratones macho C57Bl/6 J después de la incisión y el tratamiento con vehículo/fármaco. (B) Escala motora de bajo (BMS) y subpuntuación de BMS de ratones machos C57Bl/6 J después de la incisión y el tratamiento con vehículo/fármaco. Los datos se representan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de la prueba post-hoc de Sidak (*** representa p < 0,001 ** representa p < 0,01, * representa p < 0,05 en todos los casos frente al tratamiento con vehículo. # representa p < 0,05 y ### representa p < 0,001 frente al tratamiento con bupivacaína, n = 8.).

Se realizó un control de procedimiento simulado utilizando ratones C57Bl/6 J sin incisión que no mostraron diferencias en los resultados de la prueba de Von Frey o de la marcha (figura complementaria S1) entre 2 y 168 h después de la cirugía. Se utilizó un modelo similar de dolor de incisión en la pata trasera en ratones hembra para detectar cualquier diferencia en la respuesta según el sexo (Fig. 2A). Se aplicaron N-001 y un control negativo de vehículo inmediatamente a lo largo de la línea de sutura después de completarse la cirugía. Se observó un alivio significativo del comportamiento similar al dolor medido por la prueba de Von Frey para N-001 después de 2 h y continuó hasta las 72 h, mientras que el fármaco se volvió ineficaz a las 168 h. Se observó un patrón similar en la marcha donde N-001 estuvo activo hasta las 72 h (Fig. 2B). En comparación con los ratones macho, la respuesta femenina al N-001 proporcionó un umbral de retirada de la pata más bajo en el Von Frey a las 2 h y a las 6 h. Sin embargo, no hubo diferencias estadísticamente significativas en la eficacia entre los sexos cuando se analizó con ANOVA bidireccional de medidas repetidas para el tratamiento local (Figura complementaria S2). Esta respuesta al comportamiento similar al dolor es consistente con las diferencias sexuales en la percepción del dolor, donde las hembras son más sensibles al dolor que los machos32,33.

(A) Umbral de retirada de la pata trasera de ratones hembra C57Bl/6 J después de la incisión y el tratamiento con vehículo/fármaco. (B) Escala motora de bajo (BMS) de ratones hembra C57Bl/6 J después de la incisión y el tratamiento con vehículo/fármaco. Los datos se representan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de la prueba post-hoc de Sidak (*** representa p < 0,001, ** representa p < 0,01, * representa p < 0,05 en todos los casos frente al tratamiento con vehículo, # representa p < 0,05, n = 8.).

Dado que N-001 fue eficaz mediante administración periincisional, la utilidad de N-001 en un sitio distal del sitio quirúrgico se evaluó mediante bloqueo del nervio poplíteo34 en ratones machos y hembras (n = 8). Los compuestos de bloqueo nervioso probados se administraron en el espacio poplíteo (ubicado en la superficie posterior de la rodilla) del nervio ciático, seguido de una incisión en la pata trasera para iniciar la alodinia en los animales. Se incluyó un estudio de análisis de la marcha para cuantificar las diferencias en la puntuación de BMS con las diferencias en la aplicación de N-001, ya sea preoperatoriamente antes o después del bloqueo nervioso (Figura complementaria S3). N-001 redujo la alodinia y mejoró la marcha en ratones macho C57Bl/6 J (Fig. 3A). Se observó un alivio significativo del comportamiento similar al dolor medido por la prueba de Von Frey para N-001 y bupivacaína a las 6 h y se suspendió para bupivacaína a las 24 h. Por el contrario, el alivio del comportamiento similar al dolor continuó durante 72 h en los ratones inyectados con N-001. Ambos fármacos no tuvieron efecto a las 168 h. El procedimiento de prueba de la marcha resultó en diferencias positivas significativas para N-001 después de 1 día en comparación con los controles negativos, mientras que hubo una recuperación de la marcha inconsistente dentro de los grupos de tratamiento de N-001 y bupivacaína (Fig. 3B).

(A) Umbral de retirada de la pata trasera de ratones macho C57BI/6 J después del procedimiento de incisión y tratamiento con vehículo/fármaco (50 μl de bloqueo poplíteo), n = 8. (B) Escala motora baja (BMS) de ratones macho C57BI/6 J después procedimiento de incisión y tratamiento con vehículo/fármaco (50 μl de bloqueo poplíteo), n = 8. Los datos se representan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de la prueba post-hoc de Sidak (*** representa p < 0,001, * * representa p < 0,01, * representa p < 0,05 en todos los casos frente al tratamiento con vehículo, # representa p < 0,05 y ### representa p < 0,001 frente al tratamiento con bupivacaína, n = 8.).

Se utilizó un modelo similar con ratones hembra para detectar posibles diferencias dependientes del sexo (Fig. 4A). Se aplicaron N-001 y un control negativo de vehículo a través de un bloqueo del nervio poplíteo antes de la incisión. Se observó un alivio significativo del comportamiento similar al dolor medido por la prueba de Von Frey para N-001 después de 2 h y luego continuó hasta 72 h. El fármaco dejó de ser efectivo a las 168 h. El procedimiento de prueba de la marcha dio como resultado diferencias positivas significativas solo después de 1 día en comparación con los controles negativos, con un alivio de la marcha inconsistente dentro de los grupos de tratamiento de N-001 o bupivacaína (Fig. 4B). Hubo una diferencia general entre machos y hembras en la forma en que los ratones percibieron el dolor en sus respuestas al bloqueo nervioso, pero una prueba post hoc de Sidak no mostró diferencias en el umbral de retirada de la pata trasera y la eficacia de N-001 (Figura complementaria S4).

(A). Umbral de retirada de la pata trasera de ratones hembra C57BI/6 J después del procedimiento de incisión y el tratamiento con vehículo/fármaco (50 μl de bloque poplíteo), n = 7–8. (B) Escala motora de bajo (BMS) de ratones hembra C57BI/6 J después del procedimiento de incisión y tratamiento con vehículo/fármaco (50 μl de bloque poplíteo), n = 7–8. Los datos se representan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de la prueba post-hoc de Sidak (*** representa p < 0,001, ** representa p < 0,01, * representa p < 0,05 en todos los casos frente al tratamiento con vehículo) .

Se utilizaron muestras de sangre completa y suero para comprobar la toxicidad en ratones machos y hembras (n = 4). Las muestras se analizaron para determinar la química sanguínea y la citología estándar (42 parámetros). Los ratones no tenían niveles anormales para los parámetros controlados. Además, los ratones no mostraron signos de angustia ni cambios de comportamiento durante el estudio (datos complementarios). Se analizó la farmacocinética (PK) del fármaco para determinar sus parámetros farmacológicos. El límite inferior de cuantificación del ensayo para determinar el fármaco en suero sanguíneo fue de 50 ng/mL. Las curvas PK siguieron una eliminación no lineal con una Cmax a las 24 h en hembras y a las 8 h en ratones macho para los ratones inyectados tanto en MTD como en MED (Fig. 5A). El método analítico actual se dirigió a la parte activa del fármaco (C2I) utilizando un anticuerpo primario que era específico para la región C2I de N-001.

(A) La farmacocinética de N-001 se determinó mediante inyecciones IP en ratones machos y hembras en diferentes dosis (MED y MTD) a las 2,4,8,24,72 y 96 h. (B) La formación de anticuerpos antidrogas (ADA) se midió mediante ELISA. A los ratones se les inyectó N-001 en los tiempos indicados. (C) Se realizó un ensayo de potencia de faloidina para determinar la posible neutralización de N-001 mediante ADA utilizando células SH-SY5Y. Se incubó N-001 (2,4 pmol) con células con una serie de diluciones de sueros que contenían ADA y se comparó con células tratadas y no tratadas con N-001. Los datos se presentan como medias ± errores estándar de las medias (SEM) (barras de error) de cada titulación realizada por triplicado técnico.

El sistema inmunológico adaptativo se activa generalmente entre 9 y 14 días en ratones después de la inmunización. Por lo tanto, se investigó la producción de anticuerpos IgG después de 4 dosis de refuerzo sucesivas (0,8 pmol (MED)/g de peso corporal) en ratones hembra (n = 12) para identificar la presencia de anticuerpos antifármaco (ADA). Hubo un aumento lineal en la producción de ADA con dosis crecientes (Fig. 5B). Se realizó un ensayo de potencia de faloidina para determinar la neutralización potencial de N-001 según la ADA descrita anteriormente. Con las células se incubó una dosis potente conocida de N-001 (2,4 pmol) con una serie de diluciones de ADA que contenía sueros de todos los animales replicados. El ensayo de potencia se realizó con las mezclas combinadas de sueros ADA: N-001 y se comparó con células tratadas y no tratadas con N-001 (Fig. 5C). Hubo una cantidad normal de despolimerización de actina de las muestras tratadas con N-001 en relación con las células tratadas con N-001, y hubo una cantidad similar de despolimerización de actina para todas las diluciones de mezcla de sueros combinadas para los animales tratados con N-001, lo que indica que hay poca o ninguna pérdida en la potencia del N-001 cuando se combina con el ADA. Estos resultados indican que los ADA neutralizantes no se forman en respuesta a dosis repetidas de N-001.

En el presente estudio, se descubrió que N-001 fue eficaz contra el dolor posoperatorio agudo en el modelo de incisión de la pata trasera de un ratón utilizando la aplicación de fármacos de bloqueo del nervio periincisional y poplíteo. Los estudios de eficacia evaluaron los resultados nociceptivos (alodinia mecánica) y funcionales (marcha) de N-001 en un modo de dolor posquirúrgico en ratones35. La analgesia proporcionada por N-001 disminuyó significativamente la sensibilidad mecánica a los estímulos evocados y mejoró la marcha después de la incisión, al tiempo que tuvo un perfil favorable en el rendimiento general de la marcha en los grupos de control ilesos. La Basso Mouse Scale (BMS) se desarrolló inicialmente para evaluar la recuperación funcional locomotora después de una lesión de la médula espinal36. Junto con otras evaluaciones de la marcha y la carga de peso de los roedores, el BMS se puede utilizar como sustituto para la medición de los modelos de nocicepción de roedores37. Con la medición de la marcha o la carga de peso denominada nocicepción independiente del estímulo37, la combinación de resultados de mediciones nociceptivas funcionales, independientes del estímulo y dependientes del estímulo da como resultado una mayor tasa de traducción a entornos clínicos38,39. La calidad de la marcha de los animales con incisión se redujo en comparación con los controles simulados, mientras que la analgesia con N-001 hizo que los animales tratados volvieran a su marcha normal. El resultado de que N-001 restablezca la marcha normal después de la incisión en la pata proporciona evidencia que respalda su efectividad contra la nocicepción, particularmente cuando se combina con resultados de eficacia dependientes del estímulo24. La mayor duración de la eficacia a las 72 h fue notablemente más larga que la de los analgésicos actuales. Además, el comportamiento antinociceptivo en ratones fue reversible, presumiblemente porque N-001 ingresó a la célula mediante endocitosis mediada por receptores, limitando su cantidad intracelular donde modificaba reversiblemente la actina24. El modelo de incisión de la pata trasera utilizado aquí para simular el dolor postoperatorio ha sido reconocido como una herramienta útil para probar fármacos y estudiar los mecanismos del dolor postoperatorio40. El tratamiento con N-001 para el dolor agudo mejoró notablemente la alodinia mecánica en ratones y se descubrió que era eficaz 2 h después de la cirugía y duraba al menos tres días. Además, la acción del fármaco dependía de la dosis y el tiempo, y los ratones inyectados en el MTD no tuvieron efectos secundarios adversos.

En el estudio farmacocinético, la vida media de eliminación de N-001 fue relativamente larga (más de 72 h) después de la inyección IP en comparación con los analgésicos comúnmente utilizados como el fentanilo, la hidrocodona y la morfina41. El perfil farmacocinético fue específico del componente terapéutico de N-001, C2I. Además, el perfil farmacocinético de C2I no lineal podría atribuirse a un mecanismo de eliminación no uniforme del fármaco. La disposición de fármacos mediada por objetivos (TMDD) es común para moléculas grandes donde el aclaramiento depende de N-001 y su objetivo42. La concentración del fármaco en suero en el MTD tenía un perfil de picos múltiples que puede resultar de otras formas de reabsorción en el suero que promueven una recirculación sérica prolongada y resultan de la reabsorción enterogástrica o hepática43. El fármaco en el MTD se eliminó del sistema gradualmente después de 48 h tanto en ratones machos como hembras. Esto es ideal para las estrategias de tratamiento utilizadas actualmente para controlar el dolor posoperatorio porque aumenta la duración de la residencia del fármaco sin eliminación y puede haber mejorado la eficacia al ralentizar la eliminación del fármaco. Múltiples inyecciones de N-001 en ratones no desencadenaron una respuesta inmune adversa durante períodos prolongados. La duración entre dosis se simuló para reflejar la eliminación del fármaco y el tiempo necesario para la activación inmune entre cada dosis posterior. En este caso, se hizo hincapié en la detección de ADA específicos del isotipo IgG. También fue posible detectar isotipos tanto de baja como de alta unión a través de un mecanismo de detección diseñado específicamente para este propósito en el que se utilizaron diferentes títulos de ADA para verificar los efectos neutralizantes. Además, los títulos obtenidos de ratones inyectados con N-001 con un número cada vez mayor de dosis de refuerzo carecían de anticuerpos neutralizantes que de otro modo obstaculizarían la eficacia o comprometerían la seguridad de N-001.

En conclusión, los resultados indican que N-001 puede proporcionar alivio del dolor posoperatorio agudo y a una distancia significativa de la fuente periférica del dolor. La ausencia de anticuerpos neutralizantes incluso con inyecciones repetidas demuestra la capacidad de usar N-001 varias veces sin pérdida de la potencia del fármaco debido a una reacción inmune neutralizante. La eficacia demostrada después de la incisión de la pata y mediante un bloqueo del nervio poplíteo combinada con resultados anteriores utilizando modelos de dolor inflamatorio y nociceptivo, fortalece aún más la eficacia de N-001 contra un panel de desafíos de dolor nociceptivo. Dado que los animales tratados en este estudio recuperaron su función de marcha normal y los resultados anteriores demostraron especificidad neuronal sensorial in vivo e in vitro, N-001 actúa selectivamente sobre la nocicepción sin afectar la función motora24,25. El alivio del dolor nociceptivo evidente en los estudios de bloqueo nervioso combinado con resultados previos que demuestran la focalización en subtipos neuronales específicos25 sugieren que N-001 podría usarse como un bloqueo nervioso diferencial específico de nociceptores. La eliminación de TMDD, una eficacia más prolongada en comparación con los analgésicos de uso estándar y la ausencia de anticuerpos neutralizantes respaldan el uso potencial de N-001 como un nuevo analgésico de primera clase para el tratamiento del dolor posoperatorio. Los datos actuales combinados de seguridad y eficacia proporcionan evidencia de que N-001 podría ser un agente de bloqueo nervioso específico de nociceptores sin los efectos secundarios o preocupaciones de seguridad de los fármacos candidatos previamente estudiados44.

El N-001 se preparó como se describió anteriormente24,25. En resumen, las construcciones codificadas por plásmidos para C2I y C2II-C1 se expresaron en E. coli BL21. E. coli se cultivó en medio LB suplementado con ampicilina (100 µg/ml) a 37 °C y se indujo a una densidad óptica de ~ 0,6 a una longitud de onda de 600 nm con isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,5 mM. Se usó una celda de presión francesa para lisar la pasta celular a 690 bar. Se utilizó resina de glutatión (Genscript) para la purificación por afinidad. Las etiquetas de fusión GST se eliminaron usando trombina (Thermo Fisher). C2II-C1 se activó adicionalmente usando tripsina mediante incubación a 37 °C durante 30 minutos en una proporción de enzima a sustrato de 1:5 como se describió anteriormente45. Se preparó en conejos un anticuerpo policlonal personalizado dirigido al componente enzimático N-001 C2I. Los otros anticuerpos utilizados fueron el anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de ratón (H/L) (BioRad, nº de catálogo STAR207P) y el anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de ratón (H/L): HRP (BioRad, nº de catálogo STAR124P). Se utilizó sustrato Thermo Scientific Pierce TMB para ELISA.

Los procedimientos experimentales con animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Todos los protocolos experimentales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Sistema de Salud de Palo Alto de Asuntos de Veteranos o el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Nebraska-Lincoln, según el sitio de los experimentos y antes de comenzar el trabajo. Los estudios que utilizaron animales vivos siguieron las recomendaciones de las pautas de ARRIVE. Para los estudios de eficacia, se obtuvieron ratones machos y hembras de 10 a 11 semanas de edad de la cepa C57Bl/6 J o la cepa BALB/c, como se indica, de Jackson Laboratories (Bar Harbor, MA). Se realizaron experimentos de comportamiento clave en experimentos de eficacia femenina para reducir éticamente la cantidad de animales necesarios. Para los experimentos de seguridad se utilizaron ratones machos y hembras de 10 a 11 semanas de edad de la cepa BALB/c de Jackson Laboratories (Bar Harbor, MA). Todos los ratones se mantuvieron en instalaciones para animales locales un mínimo de 1 semana antes de iniciar los experimentos. Los ratones se alojaron en jaulas limpias y se mantuvieron en condiciones estándar con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, una temperatura ambiente de 22 ± 1 °C y se les permitió comida y agua ad libitum.

N-001 (3 pmol/10 μL), bupivacaína HCl (10 μL de 0,25 %, 2,5 mg/mL) o vehículo (10 μL) se administraron localmente mediante inyecciones subcutáneas intraplantares (i.pl.). Los ratones recibieron tratamiento, perioperatoriamente o después de realizar la incisión en la pata trasera. Experimentos separados evaluaron los efectos de los tratamientos anteriores sobre la incisión después del bloqueo del nervio poplíteo. El bloqueo nervioso se realizó inmediatamente antes de la incisión utilizando el método descrito por Leszczynska y Kau34. Se inyectó N-001 (30 pmol/50 μL), bupivacaína HCl (50 μL de 0,25 %, 2,5 mg/mL) o portador (50 μL) en el espacio poplíteo.

El modelo de incisión de la pata trasera se realizó como se describió anteriormente35,46. Brevemente, los ratones fueron anestesiados con isoflurano al 2-3% administrado a través de un cono nasal. Después de la preparación estéril, se realizó una incisión longitudinal de 5 mm con un bisturí del número 11 en la superficie plantar de la pata trasera derecha. Esta incisión fue lo suficientemente profunda como para dividir longitudinalmente los tejidos profundos, incluido el músculo plantar. Después de controlar el sangrado, se colocó una única sutura de nailon 6-0 a través del punto medio de la herida y se aplicó ungüento antibiótico. Las pruebas se realizaron en momentos hasta 7 días después de la incisión.

La alodinia mecánica se analizó según el algoritmo “arriba-abajo” descrito por Chaplan et al.47. Anteriormente hemos aplicado esta técnica para detectar sensibilidad en ratones tras la incisión mediante el uso de filamentos de nailon von Frey35,46. Los ratones se aclimataron en las plataformas de malla de alambre de prueba dentro de recintos de plástico transparente (10 cm en DX 40 cm en H). Posteriormente, se aplicaron fibras secuenciales con rigidez creciente 1 mm lateral al borde central de la herida y se dejaron en su lugar durante 5 s. Se definió una respuesta como la retirada de la pata trasera de la fibra y luego se aplicó una fibra menos rígida; si no se obtuvo respuesta, se aplicó la siguiente fibra más rígida de la serie. La prueba finalizó cuando se aplicaron 4 fibras después de obtener la primera respuesta.

Para evaluar los efectos del tratamiento sobre los cambios locomotores funcionales después de la incisión, se realizó un análisis de la marcha utilizando la escala de ratón Basso48. La escala Basso Mouse es una escala de calificación locomotora de 10 puntos (0 a 9). Los animales con locomoción normal alcanzan una puntuación de 9. La escala evalúa parámetros que incluyen el movimiento de las articulaciones, la capacidad de dar pasos, la coordinación y la estabilidad del tronco. Además, también se utilizó la subpuntuación de la escala Basso Mouse, más específicamente relacionada con la marcha. Esta subpuntuación cuantifica las mejoras en las áreas de frecuencia de pasos, coordinación, posición de las patas, estabilidad del tronco y posición de la cola.

La toxicidad del fármaco se evaluó después de la inyección intraperitoneal (IP) de N-001 (0,8 pmol/g de peso corporal en gramos de los ratones) o vehículo solo (solución salina tamponada con fosfato) en 64 ratones BALB/c (4 hembras, 4 machos). cada uno en 4 puntos de tiempo). Los animales fueron colocados en jaulas con nutrición adecuada y ciclo día/luz y evaluados después de 1, 3, 13 y 180 días. Los animales fueron examinados a intervalos regulares para detectar deterioro, coacción y morbilidad. Los ratones fueron sacrificados en los respectivos momentos y se recogieron suero y sangre completa mediante punción cardíaca terminal. Las muestras fueron analizadas para determinar glucosa, creatinina, BUN, ALT, bilirrubina total, bilirrubina directa, fosfatasa alcalina, LDH, AST, bilirrubina indirecta, BUN/creatinina, colesterol, triglicéridos, fósforo, calcio, potasio, sodio, proteína total, cloruro. Albúmina, globulina y osmolalidad, y un hemograma completo (prueba CBC). La prueba CBC incluyó recuento de glóbulos blancos, recuento de glóbulos rojos, hemoglobina, hematocrito, mcv (volumen corpuscular medio, tamaño promedio de eritrocitos), mch (hemoglobina corpuscular media), mchc (concentración de hemoglobina corpuscular media), rdw (ancho de distribución de glóbulos rojos), recuento de plaquetas, neutrófilos %, neutrófilos absolutos, linfocitos, linfocitos absolutos, monocitos %, monocitos abs, eosinófilos %, eosinófilos abs, basófilos %, basófilos abs.

La farmacocinética de N-001 se evaluó después de la inyección intraperitoneal (IP) de MED (dosis mínima efectiva) y MTD (dosis máxima tolerada; 10 veces MED) de N-001 8 pmol (MTD)/g de peso corporal en gramos de ratones. y 0,8 pmol (MED)/g de peso corporal en gramos de ratones) o vehículo en ratones BALB/c (4 hembras, 4 machos cada uno en 6 puntos temporales). Los animales se colocaron en jaulas con nutrición adecuada y ciclo día/luz y se evaluaron después de 2, 4, 8, 24, 48 y 168 h para los ratones inyectados con MTD y 2, 4, 8, 24, 72 y 96 h para los ratones inyectados. con MED. Los animales fueron examinados a intervalos regulares para detectar deterioro, coacción y morbilidad. La sangre se recogió mediante sangrado retroorbitario o mediante punción cardíaca terminal. El suero se diluyó en una proporción de diluyente de suero (MTD: 3:700, MED: 1:200) antes de medir la concentración de C2I mediante ELISA. Se diseñó un ELISA indirecto en el que el antígeno (homogenados de tejido) en tampón de recubrimiento (tampón carbonato-bicarbonato 0,2 M; pH 9,74) se incubó en placas ELISA de 96 pocillos con alta capacidad de unión a proteínas Nunc MaxiSorp™ con capacidad de unión de 600 a 650 ng. IgG/cm2 durante la noche a 4 °C. Se usó una IgG anti-C2I de conejo hecha a medida como anticuerpo primario (1 µg/ml), mientras que se usó una IgG anti-conejo HRP de cabra como anticuerpo indicador secundario (1:5000) que se usó para oxidar el sustrato de TMB y Se detuvo con ácido sulfúrico 0,2 M y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm.

La ADME de N-001 se evaluó después de la inyección intraperitoneal (IP) de la MED de N-001 (0,8 pmol/g de peso corporal en gramos de ratones) o vehículo solo (solución salina tamponada con fosfato) en 64 ratones BALB/c (4 hembras). , 4 machos cada uno en 4 tiempos). Los animales fueron colocados en jaulas con nutrición adecuada y ciclo día/luz y evaluados después de 1, 3, 13 y 180 días. Los animales fueron examinados a intervalos regulares para detectar deterioro, coacción y morbilidad. Los ratones fueron sacrificados en los respectivos momentos y se recolectaron tejidos (piel, cerebro, hígado, riñones, bazo, páncreas, órganos reproductivos, corazón, pulmones, colon, intestino delgado y estómago). Los homogeneizados de tejido se prepararon criocongelando tejido y utilizando un homogeneizador mecánico en un tampón RIPA con inhibidor de proteasa49. Los homogeneizados se caracterizaron para determinar la concentración de proteína total utilizando un ensayo BCA. Los homogeneizados se utilizaron ahora con un ELISA en dilución 1:200 y 1:100 en solución de bloqueo (albúmina sérica bovina al 1% en PBS; pH 7,2) para identificar la concentración de C2I presente en ellos. Se diseñó un ELISA indirecto en el que el antígeno (homogenados de tejido) en tampón de recubrimiento (tampón carbonato-bicarbonato 0,2 M; pH 9,74) se incubó en placas ELISA de 96 pocillos con alta capacidad de unión a proteínas Nunc MaxiSorp™ con capacidad de unión de 600 a 650 ng de IgG. /cm2 durante la noche a 4 °C. Se usó una IgG anti-C2I de conejo hecha a medida como anticuerpo primario (1 µg/ml), mientras que se usó una IgG anti-conejo HRP de cabra como anticuerpo indicador secundario (1:5000). La absorbancia producida por la reducción mediada por HRP de peróxido de hidrógeno y la oxidación del sustrato de TMB se midió después de detener la reacción.

A los animales (hembras, controles n = 6; muestras de prueba experimentales (N-001) n = 12) se les inyectó (0,8 pmol/g de peso corporal en gramos de los ratones) de N-001 a través de la vía de administración IP el día 1 y una dosis de refuerzo del medicamento tres veces más cada 7 días. Se eligió la vía de administración IP debido a la flexibilidad en la dosificación y a los perfiles de distribución más fáciles en comparación con el método de dosificación subcutánea. Se recogió sangre de ratones mediante sangrado retroorbitario 5 días después de la inyección IP y 10 días adicionales después de la inyección de refuerzo final. El diseño experimental se utilizó para evaluar la formación de anticuerpos antifármaco producidos en los ratones con dosis repetidas y posibles anticuerpos neutralizantes producidos contra el componente terapéutico de N-001. El diseño de los experimentos pretendía imitar el uso de N-001 como analgésico posquirúrgico. Se diseñó un ELISA indirecto donde el antígeno (N-001; 100 ng/mL) en tampón de recubrimiento (tampón carbonato-bicarbonato 0,2 M; pH 9,74) se incubó en placas ELISA de 96 pocillos con alta capacidad de unión a proteínas Nunc MaxiSorp™ con capacidad de unión. de 600 a 650 ng IgG/cm2 durante la noche a 4 °C. Las muestras de suero se diluyeron inicialmente en una proporción de 1:100 en General Serum Diluent (Immunochemistry Technologies, LLC) con azida sódica al 0,01%, seguido de valoraciones cuádruples adicionales (1:16; 1:64; 1:256; 1:1024; 1:4048). ) que se incubaron con placas prerrecubiertas con N-001. Se usó una IgG HRP de cabra anti-ratón como anticuerpo indicador secundario (1:5000) que se usó para oxidar el sustrato de TMB y la reacción se terminó usando ácido sulfúrico 0,2 M, y se determinó la absorbancia posterior a una longitud de onda de 450 nm. Medido. La presencia de anticuerpos antidrogas (ADA) fue directamente proporcional a la intensidad de la absorbancia medida. Se utilizaron controles para comparar los antecedentes, incluidas las interacciones no específicas causadas por el suero. Los anticuerpos antifármaco se analizaron para determinar la región C2I (enzimática) del fármaco N-001.

La presencia de anticuerpos neutralizantes antifármaco (ADA) se determinó mediante un ensayo de potencia descrito anteriormente24. Suero recolectado de ratones BALB/c que recibieron 4 dosis separadas de N-001 a 0,8 pmol (MED)/g de peso corporal en gramos del ratón inyectado cada 7 días. Se utilizaron células de neuroblastoma (SH-SY5Y) para probar la neutralización del suero que contiene ADA utilizando un método de tinción cuantitativa descrito previamente24. Las células SH-SY5Y se sembraron en placas de 96 pocillos con lados negros (Corning) a una densidad celular de 120.000 células/ml. Se permitió que las células se incubaran a 37 °C durante 48 h en medio de cultivo. Después de la incubación, las células se trataron durante 2 h con N-001 a 2,4 pmol o 2,4 pmol de N-001 mezclado con suero que contenía ADA 21 días después de la inyección final de N-001 en las siguientes diluciones: 1:125, 1:256, 1:1024, 1:4048 para n = 12 (réplicas biológicas) y N = 3 (réplicas técnicas). Después de la incubación, se eliminó el medio de cultivo celular y se lavó con PBS. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 3 veces con PBS, luego se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% (v/v) durante 10 minutos y luego se lavaron con PBS 3 veces. Las células se tiñeron con Alexa Fluor™ 488 Phalloidin (Invitrogen, nº de catálogo A12379) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La fluorescencia se cuantificó utilizando un lector de placas a Excitación 485 nm/Emisión 525 nm.

La significación estadística de todos los datos de eficacia se determinó mediante una prueba ANOVA de dos factores, seguida de una prueba post-hok de Sidak. La significancia se mostró como p < 0,001 (***), p < 0,01 (**) y p < 0,05 (*).

La sección de datos complementarios incluye conjuntos de datos sin procesar de estudios de seguridad realizados en este estudio. Los conjuntos de datos restantes utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

Directrices prácticas para el manejo del dolor agudo en el entorno perioperatorio: un informe actualizado del grupo de trabajo de la sociedad estadounidense de anestesiólogos sobre el manejo del dolor agudo. Anestesiología 116: 248–273, https://doi.org/10.1097/ALN.0b013e31823c1030 (2012).

Garimella, V. & Cellini, C. Control del dolor posoperatorio. Clínico. Colon rectal. Cirugía. 26, 191-196. https://doi.org/10.1055/s-0033-1351138 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

McQuay, H. Opioides en el tratamiento del dolor. The Lancet 353, 2229–2232 (1999).

Artículo CAS Google Scholar

Ling, W., Mooney, L. y Hillhouse, M. Abuso, dolor y adicción a opioides recetados: cuestiones clínicas e implicaciones. Drogas Alcohólicas. Rev. 30, 300–305 (2011).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Manhapra, A. Dependencia compleja y persistente de opioides: un síndrome de dolor crónico inducido por opioides. actual. Tratar. Optar. Onco. 1–15 (2022).

Kaufman, AR y Hersh, ED Las consecuencias políticas de las sobredosis de opioides. MÁS UNO 15, e0236815 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vadivelu, N., Kai, AM, Kodumudi, V., Sramcik, J. & Kaye, AD La crisis de los opioides: una descripción general completa. actual. Representante de dolor de cabeza. 22, 1–6 (2018).

Artículo de Google Scholar

Makary, MA, Overton, HN y Wang, P. vol. 359 (Grupo Editorial de Revistas Médicas Británicas, 2017).

Dasgupta, N., Beletsky, L. y Ciccarone, D. Crisis de opioides: no hay una solución fácil para sus determinantes sociales y económicos. Soy. J. Salud Pública 108, 182–186 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Soelberg, CD, Brown, RE, Du Vivier, D, Meyer, JE y Ramachandran, BK La crisis de opioides en EE. UU.: cuestiones legales federales y estatales actuales. Anestesia. Analgésico. 125, 1675–1681 (2017).

Artículo PubMed Google Scholar

Akkari, ACS, Munhoz, IP, Tomioka, J., de Santos, NMBF & de Santos, RF Innovación farmacéutica: diferencias entre Europa, EE. UU. y países 'pharmerging'. Gesto. Pinchar. 23, 365–380 (2016).

Artículo de Google Scholar

Hutchison, RW Desafíos en el manejo del dolor posoperatorio agudo. Soy. J. Sistema de Salud. Farmacéutica. 64, T2-T5. https://doi.org/10.2146/ajhp060679 (2007).

Artículo PubMed Google Scholar

Gabriel, RA y cols. Estrategias de última generación para ahorrar opioides para el dolor posoperatorio en pacientes quirúrgicos adultos. Experto. Opinión. Farmacóter. 20, 949–961. https://doi.org/10.1080/14656566.2019.1583743 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

de PérezVega, M. J., Ferrer-Montiel, A. & González-Muñiz, R. Recent progress in non-opioid analgesic peptides. Arch. Biochem. Biophys. 660, 36–52. https://doi.org/10.1016/j.abb.2018.10.011 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

Dimitrov, DS Proteínas terapéuticas. Métodos Mol. Biol. 899, 1–26. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-921-1_1 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tibbs, GR, Posson, DJ y Goldstein, PA Canales iónicos dependientes de voltaje en el SNP: ¿Nuevas terapias para el dolor neuropático?. Tendencias Farmacol. Ciencia. 37, 522–542. https://doi.org/10.1016/j.tips.2016.05.002 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hurst, R., Rollema, H. & Bertrand, D. Receptores nicotínicos de acetilcolina: de la ciencia básica a la terapéutica. Farmacéutico. El r. 137, 22–54 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Patapoutian, A., Tate, S. y Woolf, CJ Canales potenciales de receptores transitorios: abordar el dolor en su origen. Nat. Rev. Descubrimiento de Drogas. 8, 55–68. https://doi.org/10.1038/nrd2757 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Palmer, CB y cols. Receptores opioides atípicos: biología no convencional y oportunidades terapéuticas. Farmacéutico. El r. 233, 108014 (2021).

Artículo PubMed Google Scholar

Hser, Y.-I., Evans, E., Grella, C., Ling, W. y Anglin, D. Curso prolongado de adicción a opioides. Harv. Rev. P. Psiquiatra. Rev. 23, 76–89 (2015).

Artículo de Google Scholar

Compton, WM, Valentino, RJ y DuPont, RL Uso de polisustancias en la crisis de opioides en EE. UU. Mol. Psiquiatra. 26, 41–50 (2021).

Artículo de Google Scholar

Dina, OA, McCarter, GC, de Coupade, C. y Levine, JD Papel del citoesqueleto de la neurona sensorial en la señalización del segundo mensajero para el dolor inflamatorio. Neurona 39, 613–624 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Bhave, G. & Gereau, RW Dolores de crecimiento: el citoesqueleto como regulador crítico de la plasticidad del dolor. Neurona 39, 577–579 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Allen, D., Zhou, Y., Wilhelm, A. y Blum, P. La proteína C2C diseñada multifuncionalmente dirigida a las neuronas sensoriales periféricas con actina G intracelular confiere alivio del dolor inflamatorio. Ciencia. Rep. 10, 1-12. https://doi.org/10.1038/s41598-020-69612-9 (2020).

Artículo de Google Scholar

Pavlik, BJ, Hruska, EJ, Van Cott, KE y Blum, PH Redireccionamiento de la toxina C2 de Clostridium botulinum al citosol neuronal. Ciencia. Reps. 6, 1–10. https://doi.org/10.1038/srep23707 (2016).

Artículo de Google Scholar

Aktories, K. et al. Toxina botulínica C2 ADP-ribosilatos actina. Naturaleza 322, 390–392 (1986).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Tsuge, H. y col. Base estructural del reconocimiento de actina y ribosilación de ADP de arginina por la ι-toxina de Clostridium perfringens. Proc. Nat. Acad. Ciencia. 105(21), 7399–7404. https://doi.org/10.1073/pnas.0801215105 (2008).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Becker, DE y Reed, KL Anestésicos locales: revisión de consideraciones farmacológicas. Anestesia Prog. 59(2), 90-101. https://doi.org/10.2344/0003-3006-59.2.90 (2012).

Jayakar S. et al. Desarrollar tratamientos selectivos de nociceptores para el dolor agudo y crónico. Ciencia Transl Med. 13(619), eabj9837. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.abj9837 (2021).

Shen, J., Fox, LE y Cheng, J. Efectos diferenciales de la coadministración periférica versus central de QX-314 y capsaicina sobre el dolor neuropático en ratas. Anestesiología 117(2), 365–380. https://doi.org/10.1097/ALN.0b013e318260de41 (2012).

Puopolo, M. et al. Permeación y bloqueo de los canales TRPV1 por el derivado catiónico de lidocaína QX-314. J Neurofisiol. 109(7), 1704-1712. https://doi.org/10.1152/jn.00012.2013 (2013).

Bartley, EJ & Fillingim, RB Diferencias sexuales en el dolor: una breve revisión de los hallazgos clínicos y experimentales. Hno. J. Anaesth. 111, 52–58. https://doi.org/10.1093/bja/aet127 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Banik, RK, Woo, YC, Park, SS y Brennan, TJ Influencia de la cepa y el sexo en la sensibilidad al dolor después de la incisión plantar en el ratón. Mermelada. Soc. Anestesiol. 105, 1246-1253 (2006).

Artículo de Google Scholar

Leszczynska, K. & Kau, ST Un método de bloqueo del nervio ciático para diferenciar la anestesia local inducida por fármacos del bloqueo neuromuscular en ratones. J. Farmacol. Toxico. Métodos 27, 85–93. https://doi.org/10.1016/1056-8719(92)90026-w (1992).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Sahbaie, P., Sun, Y., Liang, DY, Shi, XY y Clark, JD El tratamiento con curcumina atenúa el dolor y mejora la recuperación funcional después de la incisión. Anestesia. Analgésico. Rev. 118, 1336-1344. https://doi.org/10.1213/ANE.000000000000189 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Basso, DM, Beattie, MS y Bresnahan, JC Una escala de calificación locomotora sensible y confiable para pruebas de campo abierto en ratas. J. Neurotrauma 12, 1-21. https://doi.org/10.1089/neu.1995.12.1 (1995).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Deuis, JR, Dvorakova, LS y Vetter, I. Métodos utilizados para evaluar las conductas dolorosas en roedores. Frente. Mol. Neurociencias. 10, 284. https://doi.org/10.3389/fnmol.2017.00284 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Gregory, NS y cols. Una descripción general de los modelos animales de dolor: modelos de enfermedad y medidas de resultado. J. Dolor 14, 1255-1269. https://doi.org/10.1016/j.jpain.2013.06.008 (2013).

Artículo PubMed Google Scholar

Shepherd, AJ & Mohapatra, DP Validación farmacológica de la marcha voluntaria y ensayos de sensibilidad mecánica asociados con el dolor inflamatorio y neuropático en ratones. Neurofarmacología 130, 18-29. https://doi.org/10.1016/j.neuropharm.2017.11.036 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Segelcke, D., Pradier, B. y Pogatzki-Zahn, E. Avances en la evaluación de las conductas del dolor y los mecanismos de los modelos de dolor posoperatorio. actual. Opinión. Fisioterapeuta. 11, 85–92 (2019).

Artículo de Google Scholar

Horn, E. & Nesbit, SA Farmacología y farmacocinética de sedantes y analgésicos. Gastrointestinal. Endosc. Clínico. N. Am. 14, 247–268. https://doi.org/10.1016/j.giec.2004.01.001 (2004).

Artículo PubMed Google Scholar

An, G. Concepto de disposición de fármacos mediada por objetivos farmacológicos en compuestos de moléculas grandes y pequeñas. J.Clin. Farmacéutico. 60, 149–163. https://doi.org/10.1002/jcph.1545 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ibarra, M., Trocóniz, IF & Fagiolino, P. Procesos de reabsorción entérica y su impacto en la farmacocinética de fármacos. Ciencia. Rep. 11, 5794. https://doi.org/10.1038/s41598-021-85174-w (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Peters, CM, Ririe, D., Houle, TT, Aschenbrenner, CA y Eisenach, JC El bloqueo de nervios periféricos selectivo por nociceptores induce hipersensibilidad mecánica retardada y neurotoxicidad en ratas. Anestesiología 120, 976–986. https://doi.org/10.1097/ALN.0000000000000088 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Barth, H. y col. La absorción celular de la toxina C2 de Clostridium botulinum requiere oligomerización y acidificación. J. Biol. Química. 275, 18704–18711. https://doi.org/10.1074/jbc.M000596200 (2000).

Artículo CAS Google Scholar

Sahbaie, P., Liang, DY, Shi, XY, Sun, Y. & Clark, JD La regulación epigenética de la expresión de genes de la médula espinal contribuye a mejorar el dolor posoperatorio y la tolerancia a los analgésicos posteriores a la exposición continua a opioides. Mol. Dolor https://doi.org/10.1177/1744806916641950 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Chaplan, SR, Bach, FW, Pogrel, JW, Chung, JM y Yaksh, TL Evaluación cuantitativa de la alodinia táctil en la pata de rata. J. Neurosci. Métodos 53, 55–63. https://doi.org/10.1016/0165-0270(94)90144-9 (1994).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Basso, DM y cols. La escala Basso Mouse para locomoción detecta diferencias en la recuperación después de una lesión de la médula espinal en cinco cepas comunes de ratones. J. Neurotrauma. 23, 635–659. https://doi.org/10.1089/neu.2006.23.635 (2006).

Artículo PubMed Google Scholar

Simpson, RJ Homogeneización de tejido de mamíferos. Puerto de primavera fría. Protocolo. 2010, pdb.prot5455 (2010).

Artículo PubMed Google Scholar

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Agradecemos el apoyo financiero de la subvención de los NIH (RFA-NS-20-011) titulada HEAL INITIATIVE Desarrollo de terapias y tecnologías dirigidas al manejo mejorado del dolor. También nos gustaría agradecer al Sistema de Atención Médica de Palo Alto de Asuntos de Veteranos, la Facultad de Medicina de Stanford, el Centro Médico de la Universidad de Stanford y la Universidad de Nebraska, Lincoln.

Neurocarrus Inc, Monterey, California, EE. UU.

Derek Allen, Samerender Nagam Hanumantharao y Paul Blum

Microbiología y Toxicología Ambiental, Universidad de California-Santa Cruz, Santa Cruz, CA, EE. UU.

Derek Allen y Paul Blum

Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE, EE. UU.

Derek Allen, Rylie McDonell y Paul Blum

Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Karen-Amanda Irvine, Peyman Sahbaie y David Clark

VA Palo Alto Health Care, Palo Alto, California, EE. UU.

David Clark

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PB, NHS, DC y DA escribieron el texto principal del manuscrito. Los datos de las figuras 1 a 4 fueron producidos por PS, KAI y DC Los datos de la figura 5 fueron producidos por NHS, DA y RKM La proteína utilizada en los experimentos para todas las figuras fue producida por DA Las figuras fueron producidas por PS, NHS y PB Todos Los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Paul Blum.

He leído la política de la revista y los autores indicados tienen los siguientes intereses en competencia; PB es el director, mientras que NHS y DA son empleados de Neurocarrus Inc., que recibió apoyo de los NIH (1R43NS120337). RM, KAI, PS y DC no declaran tener intereses en competencia.

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Allen, D., Hanumantharao, SN, McDonell, R. et al. Caracterización preclínica de la eficacia y seguridad del biológico N-001 como un nuevo analgésico para el tratamiento del dolor agudo posoperatorio. Representante científico 13, 11778 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38618-4

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Recibido: 23 de marzo de 2023

Aceptado: 11 de julio de 2023

Publicado: 21 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38618-4

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